การทดสอบการรีดิวซ์เมทิลีนบลูในของเหลวจากกระเพาะรูเมน

สัตวแพทย์จบใหม่คนหนึ่งโทรมาจากฟาร์ม โดยมีหลอดสีน้ำเงินอยู่ในมือ เธอเติมเมทิลีนบลูลงในของเหลวจากกระเพาะรูเมนเมื่อสิบนาทีก่อน แต่สีน้ำเงินยังไม่หายไป เธอถามว่าควรให้สารสีเพิ่มแก่โคหรือไม่

คำถามนี้เผยให้เห็นความเข้าใจที่คลาดเคลื่อน ในการทดสอบการรีดิวซ์เมทิลีนบลูในของเหลวจากกระเพาะรูเมน สารสีต้องใส่ลงในหลอด ไม่ใช่ให้แก่สัตว์ การทดสอบทั้งหมดเกิดขึ้นในหลอดนั้น การจับเวลาว่าสีน้ำเงินหายไปเร็วเพียงใดบอกข้อมูลเกี่ยวกับจุลินทรีย์ในตัวอย่าง ไม่ได้บอกว่าสัตว์ต้องได้รับการรักษาอะไร

ความสับสนนี้เข้าใจได้ เพราะเมทิลีนบลูปรากฏอยู่ในบริบททางสัตวแพทย์สามแบบที่แยกจากกัน บทความนี้จะแยกบริบทเหล่านั้นให้ชัดเจน และแสดงวิธีอ่านระยะเวลารีดิวซ์ร่วมกับ pH โปรโตซัว คุณภาพการเก็บตัวอย่าง และอาการทางคลินิก

การทดสอบนี้วัดอะไรจริง ๆ

เมทิลีนบลูมีสีน้ำเงินเมื่ออยู่ในรูปออกซิไดซ์ และแทบไม่มีสีเมื่ออยู่ในรูปรีดิวซ์ ของเหลวสดจากกระเพาะรูเมนของสัตว์สุขภาพดีมีสภาพรีดิวซ์สูง เนื่องจากแบคทีเรียที่ไม่ใช้ออกซิเจนกำลังหมักอาหารอย่างต่อเนื่อง เมื่อผสมสารสีปริมาณเล็กน้อยลงในของเหลวดังกล่าว กระบวนการเมแทบอลิซึมของแบคทีเรียจะทำให้สีหายไปภายในไม่กี่นาที

หลักการใช้งานจึงเรียบง่าย: กลุ่มจุลินทรีย์ที่ไม่ใช้ออกซิเจนซึ่งยังทำงานดีจะทำให้สีน้ำเงินหายไปเร็ว ส่วนกลุ่มที่ไม่ทำงานหรือได้รับความเสียหายจะทำให้สีหายไปช้า เวลาที่สั้นหมายถึงตัวอย่างนั้นมีความสามารถในการรีดิวซ์สูงกว่า เวลาที่ยาวนานชี้ว่ากิจกรรมของจุลินทรีย์ลดลง ทั้งนี้ต้องมั่นใจว่าเก็บและจัดการตัวอย่างอย่างเหมาะสม

การทดสอบนี้ไม่ได้วัดศักย์รีดอกซ์ของกระเพาะรูเมนโดยตรง งานศึกษาวิธีการในโคที่เปรียบเทียบการทดสอบการรีดิวซ์กับการวัดค่ามิลลิโวลต์โดยตรงไม่พบความสัมพันธ์เชิงเส้นระหว่างระยะเวลารีดิวซ์กับศักย์รีดอกซ์ที่วัดได้ และสรุปว่าไม่ควรใช้ค่าทั้งสองแทนกันเสมือนเป็นการอ่านตัวแปรเดียวกัน ดูสรุปการเปรียบเทียบฉบับเต็มได้ที่ PubMed ควรมองการทดสอบการรีดิวซ์เป็นการประเมินการทำงานของประชากรจุลินทรีย์ ไม่ใช่อิเล็กโทรดราคาถูก

คำอธิบายของ Merck/MSD เกี่ยวกับภาวะอาหารไม่ย่อยแบบธรรมดาในสัตว์เคี้ยวเอื้อง จัดระยะเวลารีดิวซ์ที่ยาวนานไว้ในรูปแบบความผิดปกติเดียวกับ pH ของกระเพาะรูเมนที่ผิดปกติและจำนวนโปรโตซัวที่ลดลง ไม่มีค่าใดค่าเดียวที่ใช้วินิจฉัยได้ ต้องดูรูปแบบของผลร่วมกัน

ขั้นตอนมาตรฐานที่ทำได้ข้างตัวสัตว์

ระเบียบวิธีอาจแตกต่างกันเล็กน้อยระหว่างสถาบัน จึงควรบันทึกปริมาตรและอุณหภูมิที่ใช้ให้ชัดเจน และเปรียบเทียบผลเฉพาะภายใต้ระเบียบวิธีเดียวกัน วิธีหนึ่งที่สอนกันอย่างแพร่หลายคือ:

1. เก็บของเหลวสดจากกระเพาะรูเมนอย่างน้อย 10 ถึง 20 mL โดยให้มีน้ำลายปน การสัมผัสอากาศ และการเย็นตัวน้อยที่สุด ทดสอบทันที
2. เตรียมเมทิลีนบลูความเข้มข้น 0.03 เปอร์เซ็นต์ ซึ่งเท่ากับ 0.3 mg ต่อ mL
3. เติมสารสีในปริมาตร 5 เปอร์เซ็นต์ของปริมาตรของเหลว นั่นคือสารสี 1.0 mL ต่อของเหลว 20 mL หรือสารสี 0.5 mL ต่อของเหลว 10 mL ทั้งสองแบบให้อัตราส่วนของเหลวต่อสารสีเท่ากันที่ 20 ต่อ 1
4. เก็บของเหลวที่ไม่ได้เติมสารสีจากตัวอย่างเดียวกันไว้ในหลอดที่สอง เพื่อใช้เป็นตัวควบคุมเปรียบเทียบสี
5. ผสมเบา ๆ เริ่มจับเวลาทันที และรักษาอุณหภูมิของหลอดให้ใกล้เคียงอุณหภูมิร่างกาย ประมาณ 37 ถึง 39 degrees Celsius ตามระเบียบวิธีที่ใช้ในพื้นที่
6. บันทึกเวลาจนสีในหลอดทดสอบตรงกับหลอดควบคุม อาจยังมีวงสีน้ำเงินบาง ๆ ที่ผิวสัมผัสอากาศ เพราะออกซิเจนทำให้สารสีบริเวณนั้นกลับมาอยู่ในรูปออกซิไดซ์ ไม่ต้องรอให้วงสีนั้นหายไป

เคมีรีดอกซ์ของเมทิลีนบลู อธิบายว่าเหตุใดออกซิเจนจึงสำคัญในขั้นตอนนี้ การเขย่าแรง การใช้หลอดที่เปิดปากกว้าง หรือการทิ้งไว้นานเปิดโอกาสให้ออกซิเจนเข้าไป และทำให้สารสียังคงเป็นสีน้ำเงินนานกว่าที่จะเป็นในกระเพาะรูเมนจริง รายละเอียดของเทคนิคการเก็บของเหลวจากกระเพาะรูเมนโดยลดสิ่งปนเปื้อน จึงสำคัญด้วยเหตุผลเดียวกัน น้ำลายทำให้ตัวอย่างเจือจางและเพิ่ม pH ดังนั้นเมื่อใช้สายสวนกระเพาะ สัตวแพทย์จำนวนมากจึงทิ้งของเหลวส่วนแรก หากมีปริมาตรเพียงพอ

สิ่งที่สังเกตแต่ละอย่างวัดอะไร

ระยะเวลารีดิวซ์ตอบคำถามได้เพียงข้อเดียว ตารางประเมินกระเพาะรูเมนด้านล่างแสดงว่าการสังเกตข้างตัวสัตว์แต่ละอย่างให้ข้อมูลอะไรบ้าง ควรอ่านทั้งแถว ไม่ใช่เพียงช่องเดียว

สาระสำคัญอยู่ที่ตารางนี้ ระยะเวลารีดิวซ์ที่ยาวนานร่วมกับโปรโตซัวที่เคลื่อนไหวเฉื่อย pH ผิดปกติ และการหดตัวอ่อนแรง ชี้ไปที่กิจกรรมจุลินทรีย์ที่ลดลงจริง แต่หากพบเพียงเวลาที่ยาวนานในสัตว์ที่ตื่นตัวดี เคี้ยวเอื้อง และมีโปรโตซัวเคลื่อนไหวกระฉับกระเฉง ควรสงสัยตัวอย่างมากกว่ากระเพาะรูเมน เก็บตัวอย่างซ้ำก่อนดำเนินการใด ๆ

อ่านระยะเวลาร่วมกับ pH และประวัติ

อาหารเป็นตัวกำหนดค่าพื้นฐาน อาหารที่มีอาหารข้นสูงหมักได้เร็วและอาจทำให้สารสีจางหายภายในประมาณหนึ่งนาที ขณะที่อาหารที่เป็นหญ้าแห้งอาจใช้เวลาหลายนาที แม้ในสัตว์สุขภาพดี ดังนั้นเวลาที่สั้นจึงไม่ได้พิสูจน์ว่าสุขภาพดีกว่าโดยตัวมันเอง แต่แสดงว่ามีสารตั้งต้นที่หมักได้มากขึ้นมาเจอกับจุลินทรีย์ที่ทำงานอยู่

การได้รับธัญพืชมากเกินไปอย่างรุนแรงทำให้แนวโน้มเรียบง่ายนี้เปลี่ยนไป ช่วงแรกการหมักคาร์โบไฮเดรตอาจเกิดขึ้นอย่างเข้มข้น จากนั้นความเสียหายจากกรดจะกดการทำงานของกลุ่มจุลินทรีย์ปกติและโปรโตซัว ทำให้ระยะเวลารีดิวซ์ยาวนานขึ้น นี่คือเหตุผลที่หลักหนึ่งในการสอนระบุว่าการทดสอบนี้ใช้แปลผลไม่ได้เมื่อ pH ของกระเพาะรูเมนต่ำกว่าประมาณ 5.5 เพราะเมื่อถึงจุดนั้น กลุ่มจุลินทรีย์ที่กำลังทดสอบได้เปลี่ยนไปแล้ว

แนวทางดูรูปแบบผลในทางปฏิบัติ:

• pH ปกติร่วมกับการรีดิวซ์ภายในประมาณ 6 นาที บ่งชี้ว่ากลุ่มจุลินทรีย์ยังทำงานอยู่
• pH ปกติร่วมกับระยะเวลารีดิวซ์ที่ยาวนานอย่างชัดเจน บ่งชี้ว่ากิจกรรมลดลงจากการไม่กินอาหาร ผลของยาต้านจุลชีพ หรือตัวอย่างที่มีปัญหา
• pH สูงร่วมกับระยะเวลารีดิวซ์ที่ยาวนาน มักเกิดหลังไม่กินอาหารเป็นเวลานานจนมีสารตั้งต้นน้อย แต่ต้องพิจารณาการปนเปื้อนน้ำลายจากสายสวนด้วย
• pH ต่ำร่วมกับกิจกรรมของโปรโตซัวที่ลดลง ทำให้ต้องระวังภาวะเสียสมดุลจุลินทรีย์ที่เกี่ยวข้องกับคาร์โบไฮเดรต แนวทางการแปลผล pH ของกระเพาะรูเมนช่วยได้ในกรณีนี้ ค่าต่ำกว่า 5.5 ร่วมกับอาการซึมโดยรวมชี้ไปที่การได้รับธัญพืชมากเกินไปและภาวะกรดรุนแรง มากกว่าภาวะอาหารไม่ย่อยแบบธรรมดา

ควรบันทึกประวัติการได้รับยาเตตราไซคลีนทางปากเมื่อไม่นานมานี้ การใช้ไอโอโนฟอร์ในอาหาร การได้รับยาต้านจุลชีพที่ออกฤทธิ์ทั่วร่างกายเป็นเวลานาน การเปลี่ยนสูตรอาหารอย่างฉับพลัน ระยะเวลาที่ไม่กินอาหาร และปริมาณน้ำที่กินเสมอ คู่มือ MSD เตือนโดยเฉพาะว่าเตตราไซคลีนที่ให้ทางปากอาจกดกลุ่มจุลินทรีย์ในกระเพาะรูเมนได้อย่างมาก ไอโอโนฟอร์มีจุดประสงค์เพื่อปรับประชากรแบคทีเรีย หากไม่มีประวัติเหล่านี้ ก็ไม่สามารถแปลผลเวลาที่ยาวนานได้

คุณภาพการเก็บตัวอย่างควรได้รับความสำคัญเท่ากัน งานศึกษาภายใต้สภาวะควบคุมพบว่า ตัวอย่างที่เก็บด้วยสายสวนกระเพาะมี pH สูงกว่าและมีกรดไขมันระเหยง่ายต่ำกว่าตัวอย่างที่เก็บผ่านแคนนูลาจากสัตว์ตัวเดียวกัน โดยส่วนใหญ่เป็นผลจากน้ำลาย เมื่อผ่านไป 60 นาทีหลังเก็บ ระยะเวลารีดิวซ์ยาวนานขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในทุกปริมาตรที่ทดสอบ โดยตัวอย่างขนาดเล็กได้รับผลมากที่สุด ควรเก็บอย่างน้อย 10 mL ทดสอบภายใน 30 นาที ทำการทดสอบการรีดิวซ์เป็นลำดับต้น ๆ รักษาตัวอย่างให้อุ่น และลดการสัมผัสอากาศให้น้อยที่สุด

การใช้งานสามแบบที่ต้องไม่สับสน

สารสีชนิดเดียวกัน แต่ใช้ในสามระบบที่ต่างกัน

แบบแรกคือการทดสอบของเหลวจากกระเพาะรูเมนที่อธิบายไว้ที่นี่ สิ่งส่งตรวจคือของเหลวที่เก็บจากกระเพาะรูเมน เติมสารสีในหลอดทดลองที่ความเข้มข้น 0.03 เปอร์เซ็นต์ จุดสิ้นสุดคือเวลาจนสีหายไป จุดประสงค์คือประเมินกิจกรรมการรีดิวซ์ของจุลินทรีย์

แบบที่สองคือการให้เมทิลีนบลูแก่สัตว์เคี้ยวเอื้องที่มีชีวิต ตัวอย่างการใช้งานที่เป็นที่ยอมรับคือการรักษาทางหลอดเลือดดำสำหรับภาวะพิษจากไนเตรตหรือไนไตรต์ร่วมกับภาวะเมทฮีโมโกลบินในเลือด โดยยาช่วยฟื้นการทำงานของฮีโมโกลบิน ต้องปฏิบัติตามข้อกำหนดเรื่องขนาดยา สูตรตำรับ สารตกค้าง และระยะหยุดยา การตัดสินใจนี้ไม่เกี่ยวข้องกับการจับเวลาในหลอด หากใช้สารสีเป็นสารติดตามภายในสัตว์มีชีวิตในหัตถการเฉพาะ หลักการคือดูว่าสารสีเคลื่อนที่ไปที่ใด ไม่ใช่ดูว่าจุลินทรีย์ในกระเพาะรูเมนรีดิวซ์สารสีได้เร็วเพียงใด

แบบที่สามคือการทดสอบการรีดิวซ์ในน้ำนม สิ่งส่งตรวจคือน้ำนม เติมสารสีลงในตัวอย่างน้ำนม การหายไปของสีน้ำเงินอย่างรวดเร็วโดยทั่วไปบ่งชี้ว่ากิจกรรมของจุลินทรีย์สูงกว่าและคุณภาพการเก็บรักษาด้อยกว่า ขณะที่การรีดิวซ์ช้าบ่งชี้คุณภาพที่ดีกว่า การทดสอบนี้อยู่ในงานจุลชีววิทยาอาหารและการทดสอบคุณภาพน้ำนม ไม่ใช่งานเวชศาสตร์กระเพาะรูเมน และไม่ใช่การนับจำนวนแบคทีเรีย

การเรียกชื่อให้ชัดเจนช่วยป้องกันข้อผิดพลาด: ระยะเวลารีดิวซ์ในของเหลวจากกระเพาะรูเมน การรักษาด้วยเมทิลีนบลูแบบออกฤทธิ์ทั่วร่างกายหรือการใช้เป็นสารติดตาม และการทดสอบการรีดิวซ์ในน้ำนม หลักความปลอดภัยสรุปได้ในประโยคเดียว: สารสีสำหรับการทดสอบกระเพาะรูเมนต้องอยู่ในหลอดห้องปฏิบัติการ และหลอดนั้นต้องถูกทิ้งหลังใช้งาน ห้ามให้สารสีแก่สัตว์เพื่อทำการทดสอบนี้

หลักสั้น ๆ สำหรับการให้คำปรึกษาจากฟาร์ม

กำหนดสารสีให้เป็นมาตรฐานที่ความเข้มข้น 0.03 เปอร์เซ็นต์ และอัตราส่วนสารสี 1 ส่วนต่อของเหลว 20 ส่วน ทดสอบของเหลวสดที่อุณหภูมิใกล้เคียงร่างกายโดยเทียบกับตัวควบคุมที่ไม่ได้เติมสารสี และอ่านเวลาที่ได้เป็นนาทีร่วมกับ pH การเคลื่อนไหวของโปรโตซัว คุณภาพการเก็บตัวอย่าง อาหาร ยา การหดตัว ความอยากอาหาร อุจจาระ และภาวะสมดุลน้ำ ตัวเลขเพียงค่าเดียวไม่อาจวินิจฉัยภาวะอาหารไม่ย่อยได้ แต่รูปแบบของผลที่สอดคล้องกันทำได้