การทดสอบการรีดักชันของเมทิลีนบลูในนม: หลักการและข้อจำกัด

นักศึกษาคนหนึ่งยกหลอดนมสองหลอดขึ้น หลอดหนึ่งเปลี่ยนเป็นสีขาวภายในหนึ่งชั่วโมง อีกหลอดยังคงเป็นสีน้ำเงินนานถึงห้าชั่วโมง เธอชี้ไปที่หลอดสีน้ำเงินแล้วบอกว่านมนั้นดื่มได้อย่างปลอดภัย

ข้อสรุปนั้นสะท้อนความเข้าใจพื้นฐานที่ผิด การทดสอบนมด้วยเมทิลีนบลูไม่ได้ตรวจว่านมปลอดภัยหรือไม่ แต่รายงานว่าประชากรจุลินทรีย์ในหลอดนั้นลดศักย์รีดอกซ์ได้เร็วเพียงใดภายใต้สภาวะที่กำหนดคงที่ ผลที่ใช้เวลานานหมายถึงกิจกรรมเมแทบอลิซึมโดยรวมในตัวอย่างต่ำ ไม่ได้บอกว่ามีจุลินทรีย์ชนิดใดอยู่ มีเชื้อก่อโรครวมอยู่ด้วยหรือไม่ หรือนมผ่านการพาสเจอไรซ์อย่างถูกต้องหรือไม่

ความแตกต่างนี้สำคัญเพราะการทดสอบดูน่าเชื่อถือ สีน้ำเงินหายไป นาฬิกาให้ค่าตัวเลข และตัวเลขชวนให้ตีความเกินขอบเขต บทความนี้จะคงการตีความที่เป็นประโยชน์ไว้ พร้อมป้องกันการตีความที่ไม่ปลอดภัย

การรีดักชันวัดอะไรจริง ๆ

เมทิลีนบลูมีสีน้ำเงินเมื่ออยู่ในรูปออกซิไดซ์ และแทบไม่มีสีเมื่อถูกรีดิวซ์เป็นลิวโคเมทิลีนบลู นมสดมีออกซิเจนละลายอยู่ ซึ่งช่วยให้สีย้อมคงสีน้ำเงิน แบคทีเรียที่หายใจและหมักจะใช้ออกซิเจนนั้นและปล่อยสารที่มีฤทธิ์รีดิวซ์ออกมา เมื่อศักย์รีดอกซ์ลดลงมากพอ สีย้อมจะรับอิเล็กตรอนและสูญเสียสี ตำราจุลชีววิทยานมของมหาวิทยาลัยเกวลฟ์อธิบายลำดับเดียวกันนี้ว่าเป็นการกำจัดออกซิเจน ตามด้วยการเกิดสารรีดิวซ์ระหว่างเมแทบอลิซึมของแบคทีเรีย

งานวิจัยคลาสสิกใน Journal of Dairy Science อธิบายว่าเป็นกระบวนการสองระยะ: กลุ่มจุลินทรีย์ใช้ออกซิเจนจนหมดก่อน จากนั้นองค์ประกอบของนมจึงรีดิวซ์สีย้อมอย่างรวดเร็ว ดังนั้น การทดสอบการรีดักชันของเมทิลีนบลูในนมจึงควรเข้าใจว่าเป็นการทดสอบเชิงหน้าที่เพื่อวัดกิจกรรมเมแทบอลิซึมรวม ไม่ใช่การนับเซลล์ พฤติกรรมรีดอกซ์ของเมทิลีนบลู อธิบายเคมีที่อยู่เบื้องหลังการเปลี่ยนแปลงนี้

ออกซิเจนทำให้ผลที่จุดยุติย้อนกลับได้ สีย้อมรูปรีดิวซ์หรือลิวโคที่สัมผัสอากาศจะถูกออกซิไดซ์กลับและเปลี่ยนเป็นสีน้ำเงินอีกครั้ง ดังนั้น การเขย่า การเท หลอดที่กว้าง และช่องว่างอากาศเหนือของเหลวที่มาก จึงทำให้ผลเกิดช้าลง มักมีวงสีน้ำเงินบาง ๆ คงอยู่บริเวณผิวที่สัมผัสอากาศ แม้ของเหลวส่วนหลักในหลอดจะหมดสีแล้ว ขั้นตอนมาตรฐานยอมรับวงสีน้ำเงินนี้โดยไม่ต้องรอให้หายไป

ชนิดของจุลินทรีย์เป็นอีกปัจจัยหนึ่งที่ทำให้ผลคลาดเคลื่อน โคลิฟอร์มและจุลินทรีย์ผลิตกรดแลกติกหลายชนิดรีดิวซ์สีย้อมได้เร็ว ส่วนจุลินทรีย์ที่เจริญได้ในอุณหภูมิต่ำและจุลินทรีย์ทนความร้อนหลายชนิดรีดิวซ์ได้ช้าหรือแทบไม่รีดิวซ์เลย ตัวอย่างนมสองตัวอย่างที่มีจำนวนจุลินทรีย์จากการนับบนจานเพาะเท่ากัน อาจใช้เวลาจนสีน้ำเงินหายไปต่างกันหลายชั่วโมง ข้อเท็จจริงนี้เพียงอย่างเดียวก็เพียงพอที่จะชี้ว่าไม่ควรแปลงเวลาเป็นจำนวนโคโลนี

ขั้นตอนในห้องปฏิบัติการที่ควบคุมสภาวะ

วิธีภาคสนามและวิธีในตำรามีรายละเอียดต่างกัน ผลจึงใช้ได้เฉพาะภายใต้วิธีที่ใช้ทดสอบเท่านั้น วิธีทั่วไปในห้องปฏิบัติการอาหารมีขั้นตอนดังนี้:

1. เก็บน้ำนมดิบโดยให้อากาศเข้าไปน้อยที่สุด และทำให้เย็นทันที ผสมโดยกลับภาชนะเบา ๆ ก่อนแบ่งตัวอย่าง
2. ใส่นม 10 mL ลงในหลอดปลอดเชื้อพร้อมสารละลายสีย้อมสำหรับใช้งาน 1 mL ความเข้มข้นสำหรับใช้งานที่ใช้กันแพร่หลายแบบหนึ่งคือสีย้อม 0.005 เปอร์เซ็นต์ โดยมีอัตราส่วนนมต่อสีย้อม 10 ต่อ 1
3. ปิดจุกหลอด กลับหลอดเบา ๆ สองครั้ง แล้วนำลงอ่างน้ำภายในไม่กี่นาที โดยทั่วไปบ่มที่ 35 ถึง 38 องศาเซลเซียส ขึ้นอยู่กับมาตรฐานที่ระบุ บันทึกด้วยว่าใช้มาตรฐานใด
4. ป้องกันหลอดจากแสงระหว่างการบ่ม เพราะแสงเร่งการรีดักชัน
5. อ่านผลที่ 30 นาที แล้วอ่านตามช่วงเวลาคงที่ จุดยุติคือเวลาที่สีในหลอดตรงกับนมต้มอ้างอิง หรือสีหายไปถึงระดับที่ขั้นตอนกำหนด
6. เก็บนมจากตัวอย่างเดียวกันอีกหลอดหนึ่งโดยไม่เติมสารใด ๆ ไว้เป็นตัวควบคุมสำหรับเปรียบเทียบด้วยตา หากวิธีนั้นกำหนดให้มี

คู่มือการทดสอบนมของ FAO ระบุวิธีภาคสนามของลำดับนี้ไว้อย่างชัดเจน โดยใช้นม 10 mL กับสีย้อม 1 mL ปิดจุก กลับหลอดเบา ๆ บ่มที่ประมาณ 37 ถึง 38 องศา และอ่านผลทุก 30 นาที หลอดควบคุมใช้นมต้มเพื่อทำลายระบบรีดิวซ์ตามธรรมชาติและเป็นหลักอ้างอิงในการเปรียบเทียบสี

แผนภาพด้านบนแสดงขอบเขตของการควบคุม ต้องใช้ปริมาตรเดียวกัน สีย้อมเดียวกัน อุณหภูมิเดียวกัน การผสมแบบเดียวกัน การป้องกันแสงแบบเดียวกัน และเกณฑ์จุดยุติเดียวกัน หากเปลี่ยนข้อใดข้อหนึ่ง เวลาที่วัดได้ก็เปลี่ยนตาม นี่จึงเป็นเหตุผลที่วิธีทดสอบที่บ้านซึ่งเลือกความเข้มข้นของสีย้อมตามใจ ไม่สามารถนำมาเทียบกับระดับคุณภาพในห้องปฏิบัติการได้

เวลาการรีดักชันบ่งชี้อะไร

เวลาที่นานกว่าหมายถึงกิจกรรมโดยรวมต่ำกว่าภายใต้สภาวะที่ระบุ เวลาที่สั้นกว่าหมายถึงกิจกรรมโดยรวมสูงกว่า ตารางที่ใช้สอนด้านนมกำหนดระดับคุณภาพคร่าว ๆ ตามเวลาเหล่านี้ เช่น ในระบบหนึ่งที่อ้างอิงจาก BIS เวลา 5 ชั่วโมงขึ้นไปจัดว่าดีมาก และต่ำกว่า 30 นาทีจัดว่าไม่ดี

ความแตกต่างระหว่างระบบคือประเด็นสำคัญ ผลที่ใช้เวลา 5 ชั่วโมงไม่มีระดับคุณภาพที่ใช้ได้กับทุกวิธี แต่ผูกอยู่กับขั้นตอนที่กำหนดเกณฑ์นั้น ดังนั้น รูปแบบรายงานที่มีเหตุผลรองรับจึงเป็น:

MBRT เท่ากับ X ชั่วโมง ภายใต้วิธีที่ระบุชื่อ ซึ่งสอดคล้องกับระดับคุณภาพตามวิธีนั้น

ไม่ใช่ MBRT เท่ากับ X หน่วยก่อโคโลนีต่อ mL แนวทางที่อ้างอิงจาก Standard Methods ระบุว่าไม่ควรรายงานผลการรีดักชันของสีย้อมเป็นจำนวนแบคทีเรีย ขั้นตอนการย้อมแบบง่ายด้วยเมทิลีนบลู ก็ตอบคำถามอีกแบบหนึ่งเช่นกัน เพราะแสดงรูปร่างเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ไม่ใช่กิจกรรมโดยรวมในหลอด

ตารางการตีความและข้อจำกัด

ตารางนี้เป็นข้อมูลอ้างอิงต้นฉบับสำหรับบทความ อ่านให้ครบทั้งแถว ไม่ควรแยกอ่านช่องใดช่องหนึ่งเพียงลำพัง

การตรวจที่อาศัยการเจริญ เช่น การใช้อาหารเพาะเลี้ยงแบคทีเรีย ยังคงเป็นวิธีสำหรับการนับจำนวนและการแยกเชื้อ หลอดรีดักชันใช้คัดกรอง ส่วนจานเพาะใช้ระบุและนับจำนวน

สิ่งที่การทดสอบยืนยันไม่ได้เกี่ยวกับความปลอดภัย

ผลที่ใช้เวลานานยืนยันไม่ได้ว่าไม่มีเชื้อก่อโรค เชื้อก่อโรคที่มีอยู่ในปริมาณซึ่งมีนัยสำคัญทางคลินิก อาจมีส่วนต่อการใช้ออกซิเจนโดยรวมน้อยมาก การตรวจหาเชื้อก่อโรคต้องใช้วิธีเฉพาะต่อจุลินทรีย์นั้น ซึ่ง Standard Methods ฉบับปัจจุบันจัดเป็นงานคนละส่วนกับการคัดกรองคุณภาพทั่วไป

การทดสอบนี้ตรวจยืนยันการพาสเจอไรซ์ไม่ได้ การตรวจยืนยันการให้ความร้อนใช้การทดสอบอัลคาไลน์ฟอสฟาเทส หรือวิธีอื่นที่ผ่านการตรวจสอบความใช้ได้ตามแนวทางสุขลักษณะผลิตภัณฑ์นมของ Codex หลอดสีขาวหรือสีน้ำเงินไม่ได้บอกประวัติเวลาและอุณหภูมิของนมชุดนั้น

การทดสอบนี้รับรองความปลอดภัยของอาหารไม่ได้ ความปลอดภัยขึ้นอยู่กับเชื้อก่อโรค สารพิษที่เกิดขึ้นแล้ว ยาตกค้าง สารปนเปื้อนทางเคมี ประวัติการรักษาความเย็นตลอดห่วงโซ่ และการปนเปื้อนหลังเก็บตัวอย่าง Codex มองความปลอดภัยของผลิตภัณฑ์นมเป็นชุดมาตรการควบคุมตลอดห่วงโซ่ ไม่ใช่ผลคัดกรองเพียงครั้งเดียว

บริบทห้องปฏิบัติการอาหารไม่ใช่การทดสอบที่บ้าน

ในห้องปฏิบัติการนม การทดสอบนี้ใช้คัดกรองนมที่รับเข้า เปรียบเทียบผู้ส่งมอบในช่วงเวลาต่าง ๆ หรือสอนจุลชีววิทยารีดอกซ์ภายใต้การดูแล ตัวอย่างสามารถตรวจสอบย้อนกลับได้ สารทดสอบเป็นมาตรฐาน มีการบันทึกอุณหภูมิ และของเสียเข้าสู่ระบบกำจัดของห้องปฏิบัติการ

การทดสอบที่บ้านไม่มีสิ่งเหล่านี้ ปริมาตรที่วัดในครัวเป็นเพียงค่าประมาณ ความเข้มข้นของสีย้อมที่ขายออนไลน์แตกต่างกันมาก การบ่มมักทำในห้องอุ่นแทนอ่างน้ำที่สอบเทียบแล้ว การเปลี่ยนสียังคงเกิดขึ้น ทำให้ผลดูน่าเชื่อถือ ทั้งที่ไม่มีการควบคุมใด ๆ ซึ่งทำให้ผลนั้นมีความหมาย

ความเสี่ยงที่ชัดเจนยิ่งกว่าคือพฤติกรรม หลอดสีน้ำเงินที่บ้านชวนให้ดื่มน้ำนมดิบซึ่งห้องปฏิบัติการยังต้องส่งไปนับจุลินทรีย์บนจานเพาะ คัดกรองเชื้อก่อโรค และตรวจสารตกค้าง การทดสอบนมด้วยเมทิลีนบลูออกแบบมาเพื่อจัดระดับน้ำนมดิบเมื่อรับเข้า ไม่ใช่อนุมัติให้นมนั้นนำไปบริโภคได้ การคัดกรองด้วยรีซาซูรินที่เร็วกว่า ก็มีข้อจำกัดเดียวกัน: อ่านสีได้เร็วขึ้น แต่ยังไม่ให้คำตอบเรื่องเชื้อก่อโรค

หลักสั้น ๆ สำหรับโต๊ะปฏิบัติการ

กำหนดสีย้อม อัตราส่วน อุณหภูมิ การผสม แสง และจุดยุติให้เป็นมาตรฐาน รายงานเวลาพร้อมชื่อวิธีและระดับคุณภาพ ตีความเวลาที่อ่านได้ร่วมกับประวัติการเก็บรักษา ชนิดของกลุ่มจุลินทรีย์ สารตกค้าง และคุณภาพการเก็บตัวอย่าง เวลาที่สั้นบ่งชี้กิจกรรมที่ควรตรวจสอบต่อ ส่วนเวลาที่นานไม่เคยเป็นการรับรองความปลอดภัย