เมทิลีนบลูกับการส่งสัญญาณการอักเสบ: อินฟลามมาโซม, IL-6 และ STAT3

สมมติว่าห้องปฏิบัติการสามแห่งรายงานว่าสารประกอบสีน้ำเงินชนิดเดียวกันมีฤทธิ์ต้านการอักเสบ แห่งหนึ่งพบว่าแมโครฟาจปล่อย IL-1beta น้อยลง อีกแห่งพบว่าเอนไซม์ iNOS ในเซลล์ชนิดเดียวกันลดลง ส่วนอีกแห่งพบว่า IL-6 ในเลือดและกิจกรรมของ STAT3 ในสมองลดลง เราอาจอยากรวมผลทั้งสามเป็นข้อกล่าวอ้างเดียว แต่การรวมเช่นนั้นกลับบดบังสิ่งที่ค้นพบ

ผลแต่ละอย่างเป็นเรื่องของการส่งสัญญาณคนละแบบ ซึ่งมีตัวกระตุ้น ขั้นตอนการประกอบ และตัวชี้วัดผลของตัวเอง เมทิลีนบลูมีผลต่อแต่ละแบบในจุดที่ต่างกัน ส่วนสิ่งเหล่านี้จะช่วยให้ผลลัพธ์ด้านสุขภาพดีขึ้นหรือไม่เป็นอีกคำถามหนึ่ง ซึ่งกล่าวถึงในภาพรวมเรื่องเมทิลีนบลูกับการอักเสบ ของเรา หน้านี้มุ่งอธิบายเส้นทางการส่งสัญญาณเท่านั้น

เส้นทางที่ 1: การประกอบอินฟลามมาโซมและ caspase-1

อินฟลามมาโซมคือโครงร่างโปรตีนที่สร้างขึ้นเมื่อจำเป็นภายในเซลล์สายไมอีลอยด์ ส่วนประกอบได้แก่ตัวรับรู้ โปรตีนตัวเชื่อมที่เรียกว่า ASC และเอนไซม์ปฏิบัติการที่เรียกว่า caspase-1 เมื่อประกอบเสร็จแล้ว caspase-1 จะตัด pro-IL-1beta และ pro-IL-18 ให้เป็นรูปที่หลั่งออกจากเซลล์ และอาจกระตุ้นไพโรพโทซิส ซึ่งเป็นการตายของเซลล์แบบก่อการอักเสบ ชนิดของตัวรับรู้เป็นตัวกำหนดประเภท: NLRP3 ตอบสนองต่อผลึกและสารพิษที่ทำให้เกิดรูพรุน เช่น nigericin และ ATP, NLRC4 ตอบสนองต่อแฟลเจลลินของแบคทีเรีย, AIM2 ตอบสนองต่อ DNA สายคู่ในไซโทซอล และเส้นทางแบบไม่ดั้งเดิมตอบสนองต่อไลโปพอลิแซ็กคาไรด์ภายในเซลล์

การกระตุ้นต้องอาศัยสองสัญญาณ สัญญาณแรกคือการเตรียมความพร้อม: ลิแกนด์ของตัวรับแบบ Toll กระตุ้นการถอดรหัสยีน NLRP3 และ pro-IL-1beta ที่ขึ้นกับ NF-kB เพื่อให้มีส่วนประกอบพร้อมใช้งาน สัญญาณที่สองคือการประกอบ: ตัวกระตุ้นอีกตัวทำให้ ASC รวมตัวเป็นโอลิโกเมอร์จนเกิดเป็นกลุ่มจุด ทำให้ caspase-1 ถูกตัดเป็นชิ้นส่วน p20 และทำให้ IL-1beta p17 ที่อยู่ในรูปสมบูรณ์ถูกปล่อยออกมา อนุมูลออกซิเจนไวปฏิกิริยาจากไมโทคอนเดรียและการนำผลึกเข้าสู่เซลล์เป็นปัจจัยที่ทราบว่ามีส่วนต่อสัญญาณที่สองของ NLRP3

การศึกษาในแมโครฟาจปี 2017 เกี่ยวกับการยับยั้งอินฟลามมาโซมหลายประเภท ทดสอบเมทิลีนบลูกับทั้งสองสัญญาณ ในแมโครฟาจจากไขกระดูกหนูเมาส์ที่เตรียมความพร้อมด้วยไลโปพอลิแซ็กคาไรด์ nigericin, ATP และผลึกโมโนโซเดียมยูเรตต่างกระตุ้นการปล่อย IL-1beta และ caspase-1 พร้อมกับการเกิดกลุ่มจุด ASC และเมทิลีนบลูที่ความเข้มข้น 20 ถึง 200 micromolar ลดทั้งสามอย่างตามระดับความเข้มข้นโดยไม่ทำให้เซลล์ตาย แฟลเจลลินและ Salmonella สำหรับ NLRC4, DNA สายคู่และ Listeria สำหรับ AIM2 รวมถึงไลโปพอลิแซ็กคาไรด์ที่นำเข้าสู่เซลล์หรือ E. coli ที่มีชีวิตสำหรับเส้นทางแบบไม่ดั้งเดิม ล้วนให้ผลในรูปแบบเดียวกัน สารประกอบนี้เพียงอย่างเดียวไม่ได้กระตุ้นการปล่อย และเพลตควบคุมไม่แสดงฤทธิ์ต้านแบคทีเรีย ผลที่พบจึงเกี่ยวข้องกับการตอบสนองของเซลล์เจ้าบ้าน

ในขั้นต้นน้ำ มีการวัดผลต่อสามกระบวนการ ซูเปอร์ออกไซด์จากไมโทคอนเดรียที่โรทีโนนกระตุ้นให้เกิดลดลงเมื่อมีเมทิลีนบลู และการปล่อย IL-1beta ที่โรทีโนนกระตุ้นก็ลดลงตามไปด้วย การนำเม็ดบีดเรืองแสงเข้าสู่เซลล์ลดลง ซึ่งสอดคล้องกับการลดฟาโกไซโทซิสก่อนการรับรู้ผลึก ระบบยีนรายงานที่ขับเคลื่อนด้วยโปรโมเตอร์ NLRP3 ซึ่งมีตำแหน่งจับ NF-kB สองตำแหน่ง แสดงกิจกรรมลดลงเมื่อมีเมทิลีนบลู ขณะที่โปรโมเตอร์แบบตัดสั้นซึ่งไม่มีตำแหน่งเหล่านั้นไม่ตอบสนอง ในหลอดทดลองที่ไม่มีเซลล์ เมทิลีนบลูยังลดกิจกรรมของ caspase-1 มนุษย์แบบรีคอมบิแนนต์โดยตรงด้วย การเติมสารเฉพาะในขั้นเตรียมความพร้อมหรือเฉพาะในขั้นกระตุ้นยังคงลดการปล่อย IL-1beta, IL-18 และ caspase-1 จึงแสดงว่าทั้งสองขั้นตอนมีส่วนเกี่ยวข้อง

การทดสอบในหนูเมาส์สอดคล้องกับความจำเพาะนี้ ไลโปพอลิแซ็กคาไรด์ในขนาดที่ทำให้ตายทำให้หนูกลุ่มควบคุมตายภายในไม่กี่ชั่วโมง ขณะที่เมทิลีนบลูเพิ่มการรอดชีวิต; IL-1beta ในช่องท้องลดลง แต่ IL-6 ในน้ำจากช่องท้องเดียวกันไม่ลดลง ในแบบจำลองเยื่อบุช่องท้องอักเสบจาก Listeria พบว่า IL-1beta ในช่องท้องลดลง ขณะที่จำนวนเซลล์ทั้งหมดไม่เปลี่ยนแปลง โมโนไซต์ THP-1 ของมนุษย์ตอบสนองเหมือนแมโครฟาจของหนูเมาส์ในอินฟลามมาโซมทั้งสี่ประเภท ผลเกี่ยวกับอินฟลามมาโซมอธิบายการเปลี่ยน IL-1beta และ IL-18 ให้เป็นรูปสมบูรณ์ ไม่ได้อธิบายไซโตไคน์ทุกชนิด ด้วยเหตุนี้ รูปร่างของเซลล์ภูมิคุ้มกันในสมองในการทดลองเกี่ยวกับไมโครเกลียและแอสโทรไซต์ จึงตอบคำถามคนละข้อกับการประกอบโครงร่างโปรตีน

เส้นทางที่ 2: การถอดรหัสยีน iNOS ผ่านการจับของ NF-kB และ STAT1

ไนตริกออกไซด์ซินเทสชนิดเหนี่ยวนำได้ หรือ iNOS แทบไม่มีอยู่ในภาวะพัก และมีการถอดรหัสยีนเมื่อจำเป็น ไลโปพอลิแซ็กคาไรด์กระตุ้นกระบวนการนี้เป็นหลักผ่านการสลาย IkB-alpha ตามด้วยการเติมหมู่ฟอสเฟตให้ NF-kB และการเข้าสู่นิวเคลียส ส่วนอินเตอร์เฟอรอนแกมมากระตุ้นเป็นหลักผ่านการเติมหมู่ฟอสเฟตให้ STAT1 โดยเจนัสไคเนส ตามด้วยการเข้าสู่นิวเคลียสของ STAT1 จากนั้นปัจจัยแต่ละตัวจะจับกับตำแหน่งของตนบนโปรโมเตอร์ iNOS กิจกรรมของเอนไซม์และการเหนี่ยวนำยีนเป็นจุดควบคุมที่แยกกัน และยาอาจออกฤทธิ์ที่จุดใดจุดหนึ่งหรือทั้งสองจุด

การศึกษาปี 2015 เกี่ยวกับการเหนี่ยวนำ iNOS ในแมโครฟาจและหนูเมาส์ที่มีเอนโดท็อกซินในเลือด ระบุว่าผลเกิดขึ้นที่ระดับสารสื่อจากยีน ในเซลล์ RAW 264.7 และแมโครฟาจปฐมภูมิของหนูเมาส์ เมทิลีนบลู 1 micromolar ที่ให้ก่อนเติมไลโปพอลิแซ็กคาไรด์ อินเตอร์เฟอรอนแกมมา หรือทั้งสองอย่าง 30 นาที ลดโปรตีนและ mRNA ของ iNOS ในช่วง 8 ถึง 24 ชั่วโมง โดยมีไนไตรต์ในอาหารเลี้ยงเซลล์ลดลงและไม่มีการสูญเสียความมีชีวิตของเซลล์ ในหนูเมาส์ที่ได้รับไลโปพอลิแซ็กคาไรด์ 25 mg per kg การให้เมทิลีนบลูครั้งเดียวขนาด 5 mg per kg ก่อนหน้านั้นหนึ่งชั่วโมงลดโปรตีนและ mRNA ของ iNOS ในปอด ตับ และหัวใจ

รายละเอียดที่โดดเด่นคือสิ่งที่ไม่เปลี่ยนแปลง การสลาย IkB-alpha การเติมหมู่ฟอสเฟตให้ NF-kB การเติมหมู่ฟอสเฟตให้ STAT1 และการสะสมของปัจจัยทั้งสองในนิวเคลียสยังคงดำเนินตามปกติ การสะดุดเกิดขึ้นในขั้นถัดไป: สารสกัดจากนิวเคลียสแสดงการจับของ NF-kB กับลำดับ DNA เป้าหมายที่ลดลงหลังได้รับไลโปพอลิแซ็กคาไรด์ และการจับของ STAT1 ที่ลดลงหลังได้รับอินเตอร์เฟอรอนแกมมา ส่วนการตกตะกอนโครมาตินด้วยภูมิคุ้มกันยืนยันว่าปัจจัยทั้งสองเข้าจับโปรโมเตอร์ iNOS ภายในเซลล์น้อยลง ทูเมอร์เนโครซิสแฟกเตอร์แอลฟา ซึ่งโปรโมเตอร์อาศัย NF-kB เช่นกัน ก็ลดลงด้วย ปัจจัยเหล่านี้ถูกกระตุ้นและเดินทางถึงนิวเคลียสแล้ว แต่จับกับ DNA เป้าหมายได้ไม่ดี

สังเกตความต่างจากเส้นทางที่ 1 ผลนี้เกี่ยวกับการจับระหว่างปัจจัยกับ DNA ใช้ STAT1 ไม่ใช่ STAT3 และวัดผลจาก mRNA โปรตีน และไนไตรต์ แทนที่จะเป็นกลุ่มจุด ASC และชิ้นส่วน caspase-1 แผนที่เป้าหมายของเมทิลีนบลูในแบบจำลองเซลล์ต่าง ๆ ของเราแยกระดับการถอดรหัสยีนนี้ออกจากการวัดผลโดยตรงต่อเอนไซม์และไมโทคอนเดรีย

เส้นทางที่ 3: IL-6 ในซีรัมและการกระตุ้น STAT3 ในเนื้อเยื่อ

IL-6 ส่งสัญญาณผ่านตระกูลตัวรับ gp130 เข้าสู่ลำดับการส่งสัญญาณจากเจนัสไคเนสไปยัง STAT3 เมื่อได้รับหมู่ฟอสเฟต STAT3 จะจับคู่เป็นไดเมอร์ เข้าสู่นิวเคลียส และขับเคลื่อนชุดกระบวนการอักเสบ ขณะเดียวกัน IL-6 เองก็เป็นเป้าหมายของ NF-kB ทั้งสองจึงสร้างวงจรป้อนกลับที่มักเรียกว่าแกน IL-6 ถึง STAT3 ตัวชี้วัดมาตรฐานได้แก่ IL-6 ในซีรัมที่ต้นน้ำ อัตราส่วน STAT3 ที่ได้รับหมู่ฟอสเฟตต่อ STAT3 ทั้งหมด และเอนไซม์ปฏิบัติการปลายน้ำ เช่น iNOS และ COX2

การศึกษาในหนูเมาส์ปี 2023 เกี่ยวกับ IL-6 และ STAT3 หลังได้รับไลโปพอลิแซ็กคาไรด์ วัดแกนนี้ในส่วนต่าง ๆ ของร่างกาย หนูเมาส์ C57BL/6 เพศผู้ได้รับไลโปพอลิแซ็กคาไรด์ 1 mg per kg ทุกวันเป็นเวลาสามวัน พร้อมเมทิลีนบลู 5 หรือ 10 mg per kg หลังการให้แต่ละครั้ง 30 นาที ในวันที่สาม IL-6 ในซีรัมของทั้งสองกลุ่มที่ได้รับเมทิลีนบลูต่ำกว่ากลุ่มที่ได้รับไลโปพอลิแซ็กคาไรด์เพียงอย่างเดียว ขณะที่ไซโตไคน์อื่นส่วนใหญ่ในชุดตรวจไม่เปลี่ยนแปลงตามการให้สาร อัตราส่วน STAT3 ที่ได้รับหมู่ฟอสเฟตต่อ STAT3 ทั้งหมดลดลงในคอร์เทกซ์ ฮิปโปแคมปัส และผิวหนังใบหู พร้อมกับการย้อม Iba-1 ในไมโครเกลียที่ลดลง iNOS และ COX2 ที่ลดลง และการลดลงของน้ำหนักที่บรรเทาลงบางส่วน

มีข้อควรระวังสองประการในส่วนนี้ IL-6 ในซีรัมที่ลดลงร่วมกับการเติมหมู่ฟอสเฟตให้ STAT3 ในเนื้อเยื่อที่ลดลงสอดคล้องกับการปรับการทำงานของแกนนี้ แต่ยังระบุจุดที่ได้รับผลเป็นหลักไม่ได้ เพราะไซโตไคน์ต้นน้ำที่ลดลง การส่งสัญญาณผ่านตัวรับที่ลดลง หรือกิจกรรมของฟอสฟาเทสที่เปลี่ยนไป ล้วนทำให้อัตราส่วนแบบเดียวกันเกิดขึ้นได้ อีกทั้งน้ำหนักในช่วงสามวันของการกระตุ้นแบบเฉียบพลันเป็นตัวชี้วัดระดับสัตว์ทั้งตัว ไม่ใช่คะแนนอาการหรือคะแนนการทุเลาของโรค ข้อมูลนี้เพิ่มบริบทนอกเหนือจากผลการตรวจบลอต โดยไม่ได้เปลี่ยนผลการส่งสัญญาณให้เป็นข้อกล่าวอ้างเรื่องการรักษา ส่วนเคมีของการจัดการรีดอกซ์ในไมโทคอนเดรียเป็นอีกกระบวนการหนึ่งที่ดำเนินคู่ขนานกับเรื่องไซโตไคน์นี้ และไม่ควรนำมารวมเป็นเรื่องเดียวกัน

เปรียบเทียบเส้นทาง: จุดที่สารมีผลและตัวชี้วัดผล

ตารางนี้ป้องกันการนำผลไปอนุมานข้ามเส้นทางอย่างไม่ถูกต้องสามแบบ ผลเกี่ยวกับกลุ่มจุด ASC ไม่ได้พิสูจน์ผลเกี่ยวกับ STAT3 ผลเกี่ยวกับ STAT1 กับโปรโมเตอร์ iNOS ไม่ได้พิสูจน์ผลเกี่ยวกับ STAT3 แม้โปรตีนทั้งสองจะอยู่ในตระกูล STAT เหมือนกัน ผลเกี่ยวกับ IL-6 ในซีรัมไม่ได้พิสูจน์ว่าการประกอบอินฟลามมาโซมลดลง: ในการทดลองช่องท้อง IL-1beta ลดลง แต่ IL-6 ไม่ลดลง แต่ละแถวต้องมีตัวกระตุ้นและตัวชี้วัดผลของตัวเอง ด้วยเหตุนี้ การอ่านงานศึกษาเมทิลีนบลูในเซลล์ สัตว์ และทางคลินิกจึงต้องจับคู่ข้อกล่าวอ้างแต่ละข้อกับระดับที่มีการวัดจริง

ทั้งหมดนี้ไม่ได้ยืนยันขนาดการใช้ ความปลอดภัย หรือประโยชน์ในมนุษย์ แบบจำลองไลโปพอลิแซ็กคาไรด์เป็นการใช้ตัวกระตุ้นที่ควบคุมได้เพื่อทดสอบกลไก ไม่ใช่แบบจำลองที่จำลองโรคเรื้อรังได้ทั้งหมด และการให้สารควบคู่กับตัวกระตุ้นเป็นการทดสอบการป้องกันการเปลี่ยนแปลงที่ถูกเหนี่ยวนำ ไม่ใช่การย้อนกลับของโรคที่เกิดขึ้นแล้ว ควรแยกคำอธิบายกลไกนี้ออกจากผลลัพธ์ในผู้ป่วย และประเมินข้อกล่าวอ้างด้านสุขภาพจากการศึกษาในผู้ป่วยที่รองรับข้อกล่าวอ้างนั้น