บทความ
เมทิลีนบลูในการตรวจ G6PD ทางห้องปฏิบัติการ: สีย้อมทำหน้าที่อะไรจริง ๆ
นักศึกษาคนหนึ่งสังเกตหลอดทดลองสองหลอดหลังการบ่ม หลอดหนึ่งเปลี่ยนเป็นสีที่คาดไว้ อีกหลอดไม่เปลี่ยน นักศึกษาจึงสรุปว่าผู้ป่วยรายที่สองมีภาวะพร่องเอนไซม์กลูโคส-6-ฟอสเฟตดีไฮโดรจีเนส ข้อสรุปนั้นอาจถูกต้อง แต่เหตุผลที่ใช้ข้ามแนวคิดสำคัญที่ทำให้การทดสอบนี้ทำงานได้ ไม่มีสิ่งใดในหลอดที่วัดเอนไซม์โดยตรง การทดสอบในหลอดวัดสิ่งที่เอนไซม์สร้างขึ้น โดยใช้เมทิลีนบลูเป็นตัวกลาง
เมื่อเข้าใจการวัดทางอ้อมนี้แล้ว ขั้นตอน ตัวควบคุม และสาเหตุมากมายที่ทำให้ผลคลาดเคลื่อนก็จะไม่ดูเป็นเรื่องที่กำหนดขึ้นโดยไร้เหตุผลอีกต่อไป
คำตอบสั้น ๆ
เมทิลีนบลูในการตรวจ G6PD เป็นตัวบ่งชี้ปฏิกิริยารีดอกซ์ เอนไซม์ G6PD สร้าง NADPH และระบบที่อาศัย NADPH จะรีดิวซ์เมทิลีนบลูสีน้ำเงินให้เป็นรูปแบบลิวโคที่ไม่มีสี หรือใช้เมทิลีนบลูเป็นตัวส่งผ่านอิเล็กตรอน กิจกรรมของเอนไซม์ที่ปกติทำให้เกิดการรีดิวซ์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ส่วนกิจกรรมที่พร่องทำให้การรีดิวซ์ช้าหรือไม่สมบูรณ์ นี่คือสัญญาณทั้งหมดที่การทดสอบอ่านได้
วิธีการดั้งเดิมสองวิธีใช้สีย้อมชนิดเดียวกัน แต่มีจุดยุติต่างกัน หากแยกสองวิธีนี้ให้ชัดเจน ความสับสนส่วนใหญ่ก็จะหมดไป
สองการทดสอบ สีย้อมเดียวกัน จุดยุติต่างกัน
วิธีแรกคือการทดสอบการรีดิวซ์เมทิลีนบลูโดยตรง ซึ่ง Sass และคณะได้อธิบายไว้ และ Gibbs ได้ประเมินในเวลาต่อมา ในวิธีนี้ จุดยุติคือตัวสีย้อมเอง เมทิลีนบลูในรูปออกซิไดซ์ที่มีสีน้ำเงินถูกรีดิวซ์ไปเป็นลิวโคเมทิลีนบลูที่ไม่มีสี และอัตราการเปลี่ยนแปลงนี้สะท้อนความสามารถในการสร้าง NADPH บทความต้นฉบับเกี่ยวกับการคัดกรองมีรายการอยู่ใน PubMed ภายใต้ชื่อ Sass และคณะ (1966)
วิธีที่สองคือการทดสอบการรีดิวซ์เมทฮีโมโกลบินแบบ Brewer ขั้นแรก โซเดียมไนไตรต์จะออกซิไดซ์ฮีโมโกลบินให้เป็นเมทฮีโมโกลบินสีน้ำตาล จากนั้นเมทิลีนบลูทำหน้าที่เป็นตัวกลางในการถ่ายโอนอิเล็กตรอน โดยเมทิลีนบลูที่ถูกรีดิวซ์จะส่งต่อสมมูลรีดิวซ์ให้เมทฮีโมโกลบิน ทำให้เปลี่ยนกลับเป็นฮีโมโกลบินสีแดง ดังนั้นจุดยุติที่มองเห็นจึงเป็นสีน้ำตาลเทียบกับสีแดง ไม่ใช่สีน้ำเงินเทียบกับไม่มีสี วิธีดั้งเดิมตีพิมพ์ใน วารสาร Bulletin of the World Health Organization (Brewer และคณะ, 1960)
การเรียกการทดสอบ Brewer ว่าเป็นการทดสอบการจางสีของสีย้อมจึงไม่แม่นยำในเชิงเคมี สีย้อมหมุนเวียนระหว่างรูปแบบต่าง ๆ ส่วนฮีโมโกลบินเป็นสิ่งที่เปลี่ยนสี แผนภาพด้านล่างแสดงเส้นทางของทั้งสองวิธี
ปฏิกิริยาที่เป็นพื้นฐาน
G6PD เร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันขั้นแรกของวิถีเพนโทสฟอสเฟต:
Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+
เม็ดเลือดแดงที่เจริญเต็มที่พึ่งพาวิถีนี้อย่างมากในการสร้าง NADPH ดังที่ทบทวนไว้ใน วารสาร Blood โดย Luzzatto และคณะ (2020) NADPH ช่วยคงกลูตาไธโอนให้อยู่ในรูปรีดิวซ์และปกป้องเซลล์จากความเสียหายจากออกซิเดชัน เมทิลีนบลูเข้ามามีส่วนในระบบนี้ในฐานะตัวรับอิเล็กตรอน G6PD ที่เพียงพอทำให้มี NADPH เพียงพอ ซึ่งทำให้เกิดการรีดิวซ์อย่างมีประสิทธิภาพ G6PD ที่ต่ำทำให้กระบวนการต่อเนื่องนี้ขาดตั้งแต่ขั้นแรก
ให้นึกถึงสีย้อมว่าเป็นมาตรวัดเชื้อเพลิง ไม่ใช่เครื่องยนต์ มันรายงานปริมาณ NADPH ที่มีให้ใช้ สิ่งอื่นใดที่เปลี่ยนปริมาณนี้หรือเปลี่ยนการอ่านผล ก็สามารถทำให้ค่าที่เห็นเปลี่ยนไปได้โดยที่ยีนไม่ได้เปลี่ยนแปลงเลย
ขั้นตอนการทดสอบแบบ Brewer
สูตรน้ำยาเปลี่ยนแปลงไปตลอดหลายทศวรรษ จึงไม่ควรเข้าใจคำอธิบายเพื่อการเรียนการสอนว่าเป็นแนวทางปฏิบัติทางคลินิก ห้องปฏิบัติการทุกแห่งต้องปฏิบัติตามวิธีปฏิบัติงานมาตรฐานของตนที่ผ่านการตรวจสอบความใช้ได้แล้ว เมื่อคำนึงถึงข้อควรระวังนี้ การทดสอบด้วยหลอดแบบดั้งเดิมมีขั้นตอนดังต่อไปนี้ โดยเป็นรูปแบบที่ใช้สามหลอดและบ่มนาน 3 ชั่วโมงตามที่บันทึกไว้ใน การนำวิธีนี้ไปใช้ที่มีการตีพิมพ์:
- หลอดผู้ป่วย: เลือดครบส่วนร่วมกับกลูโคส โซเดียมไนไตรต์ และเมทิลีนบลู ไนไตรต์ทำให้เกิดเมทฮีโมโกลบิน กลูโคสเป็นสารตั้งต้นสำหรับเมแทบอลิซึมของเม็ดเลือดแดง และสีย้อมทำหน้าที่เป็นตัวส่งผ่านอิเล็กตรอนที่อาศัย NADPH
- ตัวควบคุมรูปออกซิไดซ์: เลือดร่วมกับไนไตรต์และกลูโคส แต่ไม่มีเมทิลีนบลู หลอดนี้แสดงจุดยุติของเมทฮีโมโกลบินสีน้ำตาล ซึ่งเป็นรูปแบบของภาวะพร่อง
- ตัวควบคุมฮีโมโกลบิน: เลือดร่วมกับน้ำ หลอดนี้แสดงจุดยุติของฮีโมโกลบินสีแดง ซึ่งเป็นรูปแบบปกติ
- บ่ม ทุกหลอดที่อุณหภูมิใกล้ 37 C โดยทั่วไปนาน 3 ชั่วโมง พร้อมผสมเบา ๆ
- เจือจาง ตัวอย่างส่วนย่อยปริมาณเล็กน้อยจากแต่ละหลอดในน้ำกลั่น เพื่อให้เซลล์แตกและเปรียบเทียบสีได้ชัดเจน
- เปรียบเทียบ หลอดผู้ป่วยกับตัวควบคุมทั้งสอง การเปลี่ยนกลับไปทางสีแดงบ่งชี้ว่ามีความสามารถในการรีดิวซ์อยู่มาก ส่วนการคงอยู่ทางสีน้ำตาลบ่งชี้ว่าอาจมีภาวะพร่องอย่างมาก
สูตรหนึ่งในอดีตใช้เลือดประมาณ 1 mL ร่วมกับน้ำยาที่มีโซเดียมไนไตรต์ประมาณ 180 mM เดกซ์โทรส 280 mM และเมทิลีนบลู 0.4 mM ให้ถือว่าตัวเลขเหล่านี้เป็นตัวอย่างจากเอกสารวิชาการ ไม่ใช่ข้อกำหนดที่ใช้ได้กับทุกแห่ง
การอ่านผล
| รูปแบบ | ลักษณะที่เห็นในการทดสอบ Brewer | ความหมาย |
|---|---|---|
| ปกติ | หลอดผู้ป่วยมีสีใกล้เคียงกับตัวควบคุมฮีโมโกลบินสีแดง | ความสามารถในการรีดิวซ์สูงกว่าเกณฑ์ตัดของการคัดกรอง |
| พร่อง | หลอดผู้ป่วยยังเป็นสีน้ำตาล ใกล้เคียงกับตัวควบคุมเมทฮีโมโกลบิน | ผลคัดกรองบ่งชี้ว่าอาจมีภาวะพร่อง G6PD อย่างมาก |
| ก้ำกึ่ง | สีอยู่ระหว่างตัวควบคุมทั้งสอง | อย่าระบุฟีโนไทป์ ให้ตรวจวัดกิจกรรมเชิงปริมาณ |
การคัดกรองเชิงคุณภาพแยกผลได้ดีที่สุดบริเวณระดับกิจกรรมประมาณ 30 ถึง 40 เปอร์เซ็นต์ของค่าปกติ ดังที่กล่าวไว้ใน บทความทบทวนใน Malaria Journal เกี่ยวกับช่องว่างในการตรวจหา G6PD ดังนั้น ผลคัดกรองที่ปกติจึงหมายความว่าการทดสอบไม่พบภาวะพร่องรุนแรง ไม่ได้ยืนยันว่ากิจกรรมของเอนไซม์ปกติอย่างสมบูรณ์
เหตุใดการคัดกรองจึงอาจทำให้เข้าใจผิด
ภาวะเรติคูโลไซต์เพิ่มขึ้นหลังเม็ดเลือดแดงแตก เป็นสาเหตุคลาสสิกของผลปกติลวง เม็ดเลือดแดงอายุน้อยและเรติคูโลไซต์มี G6PD มากกว่าเม็ดเลือดแดงอายุมาก ระหว่างภาวะเม็ดเลือดแดงแตกเฉียบพลัน เซลล์ที่มีอายุมากที่สุดและพร่องเอนไซม์มากที่สุดอาจถูกทำลายไปแล้ว เหลือกลุ่มเซลล์อายุน้อยที่ตรวจได้กิจกรรมในระดับปกติ กลไกทางชีววิทยานี้ทำให้การตรวจเชิงปริมาณคลาดเคลื่อนได้เช่นกัน ไม่ใช่เฉพาะการคัดกรองด้วยสีย้อม
การรับเลือดเมื่อไม่นานมานี้ อาจบดบังภาวะพร่อง เพราะเม็ดเลือดแดงของผู้บริจาคนำเอนไซม์ของตนเข้ามาในสิ่งส่งตรวจด้วย Mayo Clinic Laboratories ระบุการรับเลือด เป็นหนึ่งในสาเหตุที่ทำให้ผลตรวจเอนไซม์ไม่น่าเชื่อถือ เช่นเดียวกับภาวะเรติคูโลไซต์เพิ่มขึ้นและการรบกวนจากเม็ดเลือดขาว
ผู้หญิงที่เป็นเฮเทอโรไซโกต เป็นกรณีที่ประเมินยากที่สุด การปิดการทำงานของโครโมโซม X แบบสุ่มทำให้มีเม็ดเลือดแดงทั้งที่ปกติและที่พร่องเอนไซม์ปะปนกัน และกิจกรรมโดยรวมอาจอยู่ได้ตั้งแต่พร่องอย่างรุนแรงจนถึงดูเหมือนปกติ การคัดกรองเชิงคุณภาพมักตรวจไม่พบฟีโนไทป์ระดับก้ำกึ่ง เอกสารของ WHO เกี่ยวกับการตรวจ G6PD อธิบายข้อจำกัดนี้ไว้อย่างละเอียด
ระยะเวลาหลังเก็บสิ่งส่งตรวจ อุณหภูมิการเก็บรักษา ความเป็นอัตวิสัยในการประเมินจุดยุติด้วยสายตา ฮีมาโทคริต และคุณภาพน้ำยา ล้วนเพิ่มความแปรปรวนในการวิเคราะห์นอกเหนือจากผลทางชีววิทยาเหล่านี้
การคัดกรองไม่ใช่การวินิจฉัย
ผลคัดกรองที่บ่งชี้ภาวะพร่อง ก้ำกึ่ง หรือไม่สอดคล้องกับข้อมูลทางคลินิก จำเป็นต้องได้รับ การตรวจเอนไซม์ G6PD เชิงปริมาณ WHO ถือว่าการวัดเชิงปริมาณด้วยสเปกโทรโฟโตเมตรีที่ควบคุมอุณหภูมิเป็นวิธีอ้างอิง ในการตรวจนี้ จะเติมกลูโคส-6-ฟอสเฟตและ NADP+ ลงในสารละลายที่ได้จากการทำให้เม็ดเลือดแดงแตก แล้วติดตาม NADPH ที่เกิดขึ้นจากค่าการดูดกลืนแสงที่เพิ่มขึ้นที่ 340 nm อัตราการเปลี่ยนแปลงเป็นสัดส่วนกับกิจกรรมของเอนไซม์ โดยทั่วไปจะปรับค่าเทียบกับฮีโมโกลบินและรายงานเป็นหน่วยต่อกรัม แนวปฏิบัติของห้องปฏิบัติการทางคลินิกในปัจจุบันสรุปไว้ใน รายการตรวจระดับกิจกรรม G6PD ในแค็ตตาล็อกการตรวจของ Mayo
การแปลผลใช้ช่วงอ้างอิงที่ห้องปฏิบัติการตรวจสอบความใช้ได้แล้ว โดยมักอิงกับกิจกรรมปกติของประชากร ภาวะพร่องมักพิจารณาใกล้เกณฑ์ 30 เปอร์เซ็นต์ และกิจกรรมระดับก้ำกึ่งอยู่เหนือเกณฑ์นี้ ข้อกำหนดคุณลักษณะผลิตภัณฑ์เป้าหมายของ WHO สำหรับการตรวจ G6PD (2022) กำหนดกรอบการวินิจฉัยดังกล่าวไว้ หากภาวะเม็ดเลือดแดงแตกหรือการรับเลือดเมื่อไม่นานมานี้ทำให้การระบุฟีโนไทป์ไม่น่าเชื่อถือ ให้ตรวจซ้ำหลังกลุ่มประชากรเม็ดเลือดแดงกลับเข้าสู่สมดุล และการตรวจระดับโมเลกุลอาจให้ข้อมูลเพิ่มเติมได้โดยไม่แทนที่การวัดเอนไซม์
ขอบเขตที่ควรแยกให้ชัด
เมทิลีนบลูในการทดสอบเหล่านี้เป็น สารรีเอเจนต์สำหรับห้องปฏิบัติการที่ใช้ภายนอกร่างกาย เรื่องนี้ต้องแยกจากประเด็นความปลอดภัยของการให้เมทิลีนบลูกับผู้ป่วย ซึ่งกล่าวไว้ใน คำแนะนำเกี่ยวกับข้อห้ามใช้เมทิลีนบลู ทั้งสองเรื่องเชื่อมโยงกันในทางชีวเคมี เพราะตัวยาก็อาศัยการรีดิวซ์ที่ขึ้นกับ NADPH เช่นกัน แต่สีย้อมในหลอดทดลองไม่ใช่ยาที่เข้าสู่กระแสเลือด หากต้องการบริบทเกี่ยวกับพฤติกรรมของสีย้อมในฐานะสารย้อมสีในงานอีกประเภทหนึ่ง ดู หลักการย้อมสีด้วยเมทิลีนบลู และหากต้องการข้อมูลเกี่ยวกับกลุ่มสารเคมีที่สีย้อมนี้จัดอยู่ ให้ดูเรื่องสีย้อมรีดอกซ์ในห้องปฏิบัติการ
การคัดกรองถามว่าความสามารถในการรีดิวซ์ดูเป็นปกติหรือไม่ การตรวจยืนยันถามว่ามีเอนไซม์อยู่จริงเท่าใด สีย้อมตอบคำถามแรกได้ดี ตราบใดที่ไม่มีใครขอให้มันตอบคำถามที่สอง