เมทิลีนบลูสำหรับย้อม DNA และ RNA: การใช้งานกับเจลและเมมเบรน

นักศึกษาคนหนึ่งรันเจลอะกาโรส ย้อมด้วยเมทิลีนบลู แล้วไม่เห็นอะไรตรงตำแหน่งที่คาดว่าจะมีแถบชัดเจน ที่โต๊ะทดลองข้างกัน นักวิจัยหลังปริญญาเอกย้อมเมมเบรน Northern ด้วยสีย้อมสีน้ำเงินจากขวดเดียวกัน และได้แถบไรโบโซมที่คมชัดภายในสามนาที นักศึกษาจึงสรุปว่าการรันเจลล้มเหลว แต่เจลไม่ได้ล้มเหลว งานทั้งสองอย่างแตกต่างกัน และสีย้อมเดียวกันตอบโจทย์เหล่านั้นด้วยความไว สีพื้นหลัง และข้อกำหนดสำหรับขั้นตอนถัดไปที่ต่างกัน

การย้อม DNA และการย้อม RNA ด้วยเมทิลีนบลูใช้หลักเคมีเดียวกัน แต่มีจุดประสงค์ต่างกัน ในเจล สีย้อมบอกว่ามีกรดนิวคลีอิกอยู่ในเมทริกซ์ที่มีรูพรุนมากเพียงใด บนเมมเบรน สีย้อมบอกว่าการถ่ายโอนสำเร็จหรือไม่ และใส่ตัวอย่างในแต่ละช่องอย่างสม่ำเสมอหรือไม่ เมื่อแยกความแตกต่างนี้ได้ชัดเจน วิธีปฏิบัติ ขีดจำกัดการตรวจพบ และข้อจำกัดด้านความเข้ากันได้ก็จะเข้าใจได้ง่ายขึ้น

คำตอบโดยย่อ

เมทิลีนบลูเป็นสีย้อมประจุบวกที่มีโครงสร้างแบนราบ จับกับกรดนิวคลีอิกแบบไม่ใช่พันธะโควาเลนต์และย้อนกลับได้ ผ่านทั้งแรงดึงดูดทางไฟฟ้าสถิตกับฟอสเฟต การแทรกตัวระหว่างคู่เบส และการจับกับร่องเล็กของเกลียว ความสามารถในการย้อนกลับนี้คือคุณสมบัติสำคัญ สามารถย้อมแถบ ตรวจดูด้วยแสงที่มองเห็น บันทึกภาพ แล้วล้างสีออกหรือทำให้บริสุทธิ์เพื่อใช้ในการโคลน ไฮบริไดเซชัน หรือตรวจซ้ำด้วยโพรบ

สำหรับการย้อม DNA สายคู่ในเจลอะกาโรสด้วยเมทิลีนบลู สูตรมาตรฐานแบบรวดเร็วคือ 0.02 เปอร์เซ็นต์ w/v (200 ไมโครกรัมต่อ mL) ในน้ำ ย้อมประมาณ 15 นาที แล้วล้างสีออกด้วยน้ำประมาณ 15 นาที จากนั้นตรวจดูบนกล่องแสงขาว สำหรับเมมเบรน สูตร Northern blot แบบดั้งเดิมใช้สีย้อม 0.02 ถึง 0.04 เปอร์เซ็นต์ในโซเดียมอะซีเตตที่ pH ใกล้ 5.2 ย้อมเป็นเวลาหลายนาทีหลังถ่ายโอนและตรึงตัวอย่าง จากนั้นล้างด้วยน้ำและล้างสีออกให้หมดก่อนทำไฮบริไดเซชัน ความไวอยู่ในระดับไม่สูงนัก คือระดับหลายสิบถึงหลายร้อยนาโนกรัมต่อแถบในเจลภายใต้สภาวะที่เหมาะสม ส่วนแนวทางที่ประเมินแบบเผื่อความปลอดภัยระบุไว้ที่ 0.5 ถึง 1 ไมโครกรัม ซึ่งสูงกว่าขีดจำกัดการตรวจพบของเอทิเดียมโบรไมด์และสีย้อม SYBR หลายลำดับขนาด สำหรับเมมเบรน ไม่มีค่าขีดจำกัดการตรวจพบทรานสคริปต์แต่ละชนิดเพียงค่าเดียวที่ใช้ได้จริง เพราะสีย้อมแสดง RNA ของไรโบโซมที่มีปริมาณมากและปริมาณสารทั้งหมดที่ใส่เป็นหลัก อย่าใช้สารละลายผลิตภัณฑ์เสริมอาหารที่จำหน่ายปลีกแทนสีย้อมในสูตรใดสูตรหนึ่ง วิธีที่ผ่านการตรวจสอบความใช้ได้ตั้งอยู่บนสมมติฐานว่าใช้สีย้อมเกรดวิเคราะห์ บัฟเฟอร์ที่กำหนดองค์ประกอบชัดเจน และจัดการตัวอย่างโดยปราศจาก RNase เมื่อต้องทำงานกับ RNA

กลไกการจับ และจุดที่อาจทำให้ตีความผิด

แบบจำลองที่ช่วยอธิบายการใช้งานมีสามส่วน ส่วนแรก ระบบวงแหวนที่มีประจุบวกถูกดึงดูดเข้าหาโครงกระดูกฟอสเฟตที่มีประจุลบ งานศึกษาด้วยสเปกโทรสโกปีพบว่าปฏิสัมพันธ์ทางไฟฟ้าสถิตนี้มีบทบาทหลักเมื่อความเข้มข้นของเกลือต่ำ ขณะที่การสร้างแบบจำลองและพลวัตเชิงโมเลกุลยังระบุว่าการแทรกตัวระหว่างคู่เบสและการจับกับร่องเล็กเป็นรูปแบบการจับที่เสถียรสำหรับ DNA สายคู่ ดังที่สรุปไว้ในการศึกษาการจับระหว่างเมทิลีนบลูกับ DNA ด้วยสเปกโทรสโกปี ส่วนที่สอง มีความชอบจับกับ GC อยู่บ้าง โดยแบบจำลองสนับสนุนการจับบริเวณลำดับ CpG และ GpC และการทดลองรายงานว่าจับกับสายคู่ที่มี GC สูงได้มากกว่าในงานเรื่องความชอบในการแทรกตัวระหว่างคู่เบสของเมทิลีนบลู แต่สายคู่ AT ก็จับได้เช่นกัน การย้อมทั่วไปไม่ได้จำเพาะต่อลำดับเบส ส่วนที่สาม DNA สายเดี่ยวและ RNA จับผ่านแรงทางไฟฟ้าสถิตและการซ้อนเรียงกับเบสที่เข้าถึงได้ รวมถึงบริเวณที่เป็นสายคู่เป็นหลัก จึงทำให้ความเข้มของการย้อมแตกต่างกันตามความยาว ลำดับเบส และโครงสร้างทุติยภูมิ

กลไกนี้นำไปสู่ผลสองประการ เนื่องจากการจับไม่ใช่พันธะโควาเลนต์ สีย้อมจึงล้างออกได้ แถบในพอลิอะคริลาไมด์จะจางลงอย่างรวดเร็วหากไม่ได้ตั้งใจตรึงไว้ และมีวิธีดัดแปลงสำหรับตรึงสีอย่างถาวรโดยเฉพาะก็เพราะการย้อมตามปกติเป็นเพียงชั่วคราว ดังที่อธิบายโดย Soto และ Draper สำหรับเจล PAGE อีกประการหนึ่งคือ สีย้อมเป็นสารไวแสง การฉายแสงสว่างเป็นเวลานานบน DNA ที่ย้อมแล้วในสภาวะที่มีออกซิเจนจึงอาจออกซิไดซ์กวานีนและท้ายที่สุดทำให้เกิดรอยขาดบนสาย DNA กลไกนี้อธิบายไว้ในงานเรื่องการออกซิเดชันของกวานีนที่กระตุ้นด้วยเมทิลีนบลู การตรวจดูด้วยแสงขาวช่วงสั้น ๆ ช่วยหลีกเลี่ยงความเสียหายจาก UV ที่เป็นที่ทราบกันดีในขั้นตอนแบบดั้งเดิมที่ใช้เอทิเดียมโบรไมด์ และเป็นข้อได้เปรียบจริงเมื่อกู้คืน DNA เพื่อนำไปใช้ต่อ แสงที่มองเห็นอ่อนโยนกว่า แต่ไม่ได้ปราศจากอันตราย ควรฉายแสงให้สั้นเมื่อจะนำ DNA ไปโคลน สำหรับภาพรวมของเคมีเชิงแสงที่อยู่เบื้องหลังข้อควรระวังนี้ ดูสองเส้นทางในเคมีเชิงแสงของเมทิลีนบลู สำหรับคู่รีดอกซ์และสถานะประจุที่อธิบายว่าเหตุใดรูปออกซิไดซ์จึงจับได้ แต่รูปรีดิวซ์จับไม่ได้ ดูเคมีของโครงสร้างและสมบัติของเมทิลีนบลู

งานที่หนึ่ง: การย้อมภายในเจล

การย้อมเจลตอบคำถามหนึ่งข้อ คือมีกรดนิวคลีอิกในแถบนี้มากพอให้มองเห็นด้วยตาหรือไม่ DNA สายคู่ในอะกาโรสเป็นกรณีที่มีข้อมูลรองรับชัดเจนที่สุด วิธีย้อมเจลด้วยเมทิลีนบลูต้นฉบับของ Flores และคณะ ตรวจสอบความใช้ได้ของวิธีแบบรวดเร็วที่ความเข้มข้น 0.02 เปอร์เซ็นต์กับอะกาโรส 1 เปอร์เซ็นต์ และแสดงว่าสามารถกู้คืน DNA และโคลนต่อได้สำเร็จ วิธีเดียวกันจากผู้จำหน่ายปรากฏในหน้าผลิตภัณฑ์เมทิลีนบลูของ IBI Scientific ซึ่งแสดงสูตรสำหรับเมมเบรนที่ความเข้มข้น 0.04 เปอร์เซ็นต์ควบคู่กับวิธีย้อมเจลแบบรวดเร็ว

ขั้นตอนปฏิบัติ:

1. รันเจลตามปกติ ย้อมหลังอิเล็กโทรโฟรีซิส ไม่ใช่ระหว่างรัน เว้นแต่จะตรวจสอบความใช้ได้ของการถ่ายโอนหรือความสามารถในการแยกแถบสำหรับวิธีดัดแปลงแล้ว
2. แช่ในเมทิลีนบลู 0.02 เปอร์เซ็นต์ w/v ในน้ำกลั่น พร้อมเขย่าเบา ๆ ประมาณ 15 นาที
3. ล้างสีออกโดยเปลี่ยนน้ำหลายครั้ง รวมประมาณ 15 นาที จนสีพื้นหลังของเมทริกซ์ลดลงและเห็นแถบเด่นชัด
4. ถ่ายภาพทันทีบนเครื่องส่องแสงขาว

อะกาโรสและพอลิอะคริลาไมด์มีพฤติกรรมต่างกัน อะกาโรสกักสีย้อมไว้ในเมทริกซ์ การล้างสีออกจึงเป็นขั้นตอนที่ช้า เจลพอลิอะคริลาไมด์บางย้อมติดเร็ว แต่ก็สูญเสียสีเร็วเช่นกัน ซึ่งช่วยในการตัดแถบเพื่อนำไปใช้ต่อ แต่ไม่เหมาะกับการเก็บบันทึกระยะยาว สามารถระบุตำแหน่งโอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์ในพอลิอะคริลาไมด์ด้วยสูตร 0.02 เปอร์เซ็นต์เดียวกันภายใน 20 ถึง 30 นาที โดยล้างน้ำซ้ำ ตามวิธี PAGE ที่ใช้กันอยู่ในแนวทางของ Current Protocols มีรายงานวิธีที่เจือจางมาก โดยใช้ความเข้มข้นใกล้ 0.0002 เปอร์เซ็นต์ใน TBE เจือจางเพื่อเตรียมโอลิโกสำหรับนำไปใช้ต่อ โดยใช้เวลาหลายชั่วโมง แต่หลักฐานรองรับยังน้อยกว่า

ความแตกต่างระหว่าง DNA กับ RNA มีความสำคัญ DNA สายคู่ให้การจับแบบมีโครงสร้างที่แข็งแรงที่สุด RNA และ DNA สายเดี่ยวติดสีได้ แต่ติดอ่อนกว่าและคาดการณ์ได้ยากกว่า สำหรับเจล RNA อะกาโรสที่มีฟอร์มาลดีไฮด์ ห้องปฏิบัติการส่วนใหญ่ข้ามการย้อมสีน้ำเงินในเจล และถ่ายโอน RNA ไปยังเมมเบรนก่อน แล้วจึงย้อมบนเมมเบรน การเปลี่ยนขั้นตอนนี้แลกสัญญาณในเจลที่อ่อนกับสัญญาณบนเมมเบรนที่ชัดกว่า พร้อมบันทึกปริมาณตัวอย่างที่ใส่

งานที่สอง: การย้อมบนเมมเบรน

การย้อมเมมเบรนตอบคำถามอีกแบบหนึ่ง คือการถ่ายโอนสำเร็จหรือไม่ และแต่ละช่องเปรียบเทียบกันได้หรือไม่ การใช้งานแบบดั้งเดิมคือการย้อม Northern blot แบบย้อนกลับได้ของ Herrin และ Schmidt ซึ่งเดิมใช้สีย้อม 0.04 เปอร์เซ็นต์ในโซเดียมอะซีเตต 50 mM ที่ pH 5.0 เป็นเวลา 2 ถึง 3 นาที แล้วล้างด้วยน้ำ สามารถล้างสีออกด้วย SDS เจือจางใน SSPE ก่อนทำไฮบริไดเซชัน

วิธีดัดแปลงสมัยใหม่ที่ใช้กันแพร่หลายมีขั้นตอนดังนี้:

1. ถ่ายโอน RNA หรือ DNA ที่แยกสายแล้วไปยังไนลอนหรือไนโตรเซลลูโลส จากนั้นตรึงด้วยการเชื่อมขวางด้วย UV หรือการอบ เพื่อไม่ให้ตัวอย่างหลุดออกระหว่างย้อม
2. ขั้นตอนทางเลือกที่ใช้กันบ่อย: ทำให้เมมเบรนเปียกด้วยกรดอะซิติก 5 เปอร์เซ็นต์ประมาณ 15 นาที
3. ย้อม 5 ถึง 10 นาทีในเมทิลีนบลู 0.02 ถึง 0.04 เปอร์เซ็นต์ในโซเดียมอะซีเตต 0.3 ถึง 0.5 M ที่ pH ใกล้ 5.2
4. ล้างและล้างสีออกด้วยน้ำเป็นเวลา 5 ถึง 15 นาที บันทึกภาพ แล้วกำจัดสีย้อมที่เหลือก่อนทำไฮบริไดเซชัน

ไนลอนที่มีประจุบวกเป็นวัสดุหลักในงาน Northern ไนโตรเซลลูโลสก็ใช้ได้กับขั้นตอนกรดอะซิติกร่วมกับอะซีเตตแบบเดียวกัน ภาพที่ได้ใช้ยืนยันการถ่ายโอน เปรียบเทียบแถบ 28S และ 18S (หรือ 23S และ 16S สำหรับ RNA ของแบคทีเรีย) ทำเครื่องหมายตำแหน่งบันไดขนาดและสารมาตรฐาน และเก็บบันทึกคร่าว ๆ สำหรับปรับเทียบปริมาณ RNA ทั้งหมด วิธี Northern ที่ตีพิมพ์แล้วมีการวัดปริมาณแถบไรโบโซมที่ย้อมสีเพื่อตรวจสอบปริมาณตัวอย่าง รวมถึงงานด้านวิทยาศาสตร์การโคนมที่ใช้แถบไรโบโซมที่ย้อมด้วยเมทิลีนบลูเพื่อปรับเทียบปริมาณ เมมเบรน Southern สามารถตรวจดูด้วยวิธีเดียวกันได้ แต่สีย้อมนี้มีการใช้เป็นที่ยอมรับมากกว่าอย่างชัดเจนสำหรับตรวจสอบการใส่ตัวอย่างและการถ่ายโอนในงาน Northern และ DNA สำหรับ Southern ถูกแยกสายก่อนถ่ายโอน จึงนำค่าความไวในเจลมาใช้ตรง ๆ ไม่ได้

ขีดจำกัดการตรวจพบและสีพื้นหลัง: จุดที่สีย้อมสีน้ำเงินเป็นรอง

การเปรียบเทียบด้านล่างตั้งใจแสดงค่าโดยประมาณ ประสิทธิภาพของสีย้อมขึ้นอยู่กับเปอร์เซ็นต์เจล ความกว้างของแถบ ระบบแสง และความสม่ำเสมอในการล้างสีออก ให้ถือว่าตัวเลขแต่ละค่าแสดงระดับขนาด ไม่ใช่ข้อกำหนดตายตัว

การควบคุมสีพื้นหลังเป็นตัวกำหนดว่าสัญญาณที่ไม่สูงนักจะใช้งานได้หรือไม่ สีย้อมอิสระมีสีเข้มมาก ความต่างระหว่างแถบกับพื้นหลังจึงเกิดจากการกำจัดสีย้อมที่ไม่ได้จับ โดยไม่ชะสีย้อมที่จับอยู่ออกไป สีย้อมที่เข้มข้นขึ้นมักไม่ได้เพิ่มความไว แต่ส่วนใหญ่เพิ่มเวลาล้างสีออก ควรทดสอบชุดความเจือจางกับเจล เมมเบรน และกล้องที่จะใช้จริง และใช้เฉพาะช่วงที่ค่าความเข้มรวมยังแปรผันตามปริมาณตัวอย่างที่ใส่ เมทิลีนบลูใช้ปรับเทียบปริมาณตัวอย่างแบบกึ่งเชิงปริมาณได้ แต่ไม่ใช่วิธีวิเคราะห์เชิงปริมาณที่มีช่วงไดนามิกกว้าง เพราะความจุของเมมเบรน ประสิทธิภาพการถ่ายโอน การอิ่มตัว และการล้างสีออกแตกต่างกันในแต่ละช่อง

ข้อจำกัดด้านความเข้ากันได้: ขั้นตอนใดทำต่อหลังย้อมได้

มีหลักฐานว่าสามารถโคลนหลังย้อมสีน้ำเงินได้ Flores และคณะตัดแถบอะกาโรสที่ย้อมแล้ว กู้คืน DNA เชื่อมต่อด้วยไลเกชัน และนำเข้าสู่เซลล์ โดยรายงานผลการโคลนที่ดีกว่าหลังใช้เอทิเดียมโบรไมด์ร่วมกับ UV เหตุผลที่เป็นไปได้คือความเสียหายจากแสงน้อยกว่า ไม่ใช่ประโยชน์จากสีย้อมเอง ควรให้สัมผัสแสงขาวเพียงช่วงสั้น ๆ และทำ DNA ที่กู้คืนได้ให้บริสุทธิ์ด้วยขั้นตอนสกัดจากเจลตามปกติ

หลักฐานสำหรับ PCR และการหาลำดับเบสยังมีน้อยกว่า สีย้อมที่ตกค้างจับกับกรดนิวคลีอิก จึงควรล้างสีออกและทำให้บริสุทธิ์ก่อนขั้นตอนที่ใช้เอนไซม์ คาดว่า DNA จากเจลที่ย้อมสีน้ำเงินและทำให้บริสุทธิ์อย่างเหมาะสมจะใช้งานได้ แต่ยังไม่มีข้อมูลเชิงปริมาณที่ชัดเจนว่าพอลิเมอเรสและเคมีสำหรับหาลำดับเบสชนิดต่าง ๆ ทนต่อสีย้อมที่ปนไปได้มากเพียงใด อย่าตั้งสมมติฐานว่าไม่มีปัญหา

การทำไฮบริไดเซชันบนบลอตเข้ากันได้เมื่อปฏิบัติตามลำดับอย่างเคร่งครัด: ถ่ายโอน ตรึง ย้อม บันทึกภาพ ล้างสีออก แล้วทำไฮบริไดเซชัน ลำดับนี้เป็นการออกแบบของ Herrin และ Schmidt การย้อมก่อนถ่ายโอน หรือข้ามการล้างสีออก ถือเป็นอีกวิธีหนึ่งและต้องตรวจสอบความใช้ได้แยกต่างหาก หลังนำสีย้อมออกแล้ว สามารถลอกโพรบและตรวจซ้ำด้วยโพรบตามวิธีมาตรฐานได้ตามปกติ สำหรับการย้อมระดับเซลล์ด้วยสีย้อมกลุ่มเดียวกัน และเหตุผลที่แนวคิดสำหรับฟิล์มตัวอย่างที่ตรึงแล้วใช้กับวิธีสำหรับเซลล์มีชีวิตไม่ได้ ดูแอตลาสการย้อมสำหรับกล้องจุลทรรศน์

การตัดแถบใช้ได้กับอะกาโรสสำหรับเตรียมสารเพื่อนำไปใช้ต่อ และกับโอลิโกใน PAGE ที่ระบุตำแหน่งด้วยสีย้อมสีน้ำเงิน โดยต้องหลีกเลี่ยงวิธีตรึงสีแบบถาวร การชะออกด้วยไฟฟ้าหลังล้างสีออกมีความเป็นไปได้ทางเคมีสำหรับสารที่จับแบบย้อนกลับได้ แต่ข้อมูลผลได้จากการทดลองที่มีการควบคุมและเจาะจงเมทิลีนบลูยังมีน้อย ควรกำจัดเกลือหรือตกตะกอนหลังชะออก

ปัญหาที่เกิดซ้ำ

แถบเจลที่จางมักหมายถึงมีมวลสารน้อยเกินไปสำหรับสีย้อมที่ตรวจด้วยสี โดยเฉพาะเป้าหมายสายเดี่ยวสั้น ๆ หรือ RNA ให้เพิ่มปริมาณตัวอย่าง ใช้สีย้อมสดใหม่ เพิ่มเวลาย้อมก่อนเพิ่มความเข้มข้น และหยุดล้างสีออกให้เร็วขึ้น เจลที่เป็นสีน้ำเงินทั้งก้อนโดยไม่มีความต่างระหว่างแถบกับพื้นหลังมักหมายถึงย้อมมากเกินไปหรือเปลี่ยนน้ำน้อยเกินไป แถบ PAGE ที่จางลงเป็นผลทางเคมีที่คาดหมายได้ ไม่ใช่การย้อมที่ล้มเหลว ควรถ่ายภาพอย่างรวดเร็ว สีพื้นหลังบนเมมเบรนที่ไม่สม่ำเสมอชี้ถึงรอยพับ ฟองอากาศ รอยนิ้วมือ การเขย่าที่ไม่สม่ำเสมอ หรือการถ่ายโอนที่ไม่ทั่วถึง อย่าตีความว่าใส่ตัวอย่างไม่เท่ากันหากไม่มีการควบคุมด้วยไฮบริไดเซชัน รูปแบบแถบไรโบโซมที่จางและเป็นปื้นอาจหมายถึงการเสื่อมสลาย แต่ก็อาจเกิดจากการถ่ายโอนไม่สมบูรณ์ ปริมาณ RNA ทั้งหมดน้อยเกินไป (แต่ละช่องโดยทั่วไปมีหลายไมโครกรัมถึงหลายสิบไมโครกรัม) หรือการล้างสีออกมากเกินไป สีย้อมแสดง RNA ของไรโบโซมที่มีปริมาณมาก ไม่ได้แสดงทรานสคริปต์จำเพาะ หน้าที่นั้นเป็นของโพรบ

ความปลอดภัยและการจัดการโดยไม่กล่าวเกินจริง

เมทิลีนบลูจัดการได้ง่ายกว่าเอทิเดียมโบรไมด์ แต่ไม่ได้ปราศจากอันตราย เอกสารข้อมูลความปลอดภัยฉบับปัจจุบันของ MilliporeSigma จัดสีย้อมนี้เป็นสารที่มีความเป็นพิษเฉียบพลันทางปากประเภท 4 เป็นอันตรายหากกลืนกิน และต้องกำจัดผ่านช่องทางจัดการของเสียที่ได้รับอนุมัติ ตามเอกสาร SDS ของเมทิลีนบลูจาก Sigma-Aldrich เอทิเดียมโบรไมด์มีคำเตือนด้านความเป็นพิษต่อสารพันธุกรรมที่รุนแรงกว่า รวมถึงข้อสงสัยเกี่ยวกับผลต่อเซลล์สืบพันธุ์ในเอกสาร SDS ของเอทิเดียมโบรไมด์จาก Sigma-Aldrich และโดยทั่วไปเจลกับสารละลายของสารนี้ถูกแยกเป็นของเสียสารเคมีอันตราย ดังที่ระบุในคู่มือสีย้อมกรดนิวคลีอิกของ Thermo Fisher ปฏิบัติตาม SDS และข้อกำหนดของสถาบันสำหรับสารทั้งสองชนิด เก็บสีย้อมแห้งให้แห้งและปิดภาชนะให้สนิท นำสารละลายสีย้อมที่ใช้งานแล้วกลับมาใช้เฉพาะตามที่วิธีปฏิบัติอนุญาต เก็บเมมเบรนที่ย้อมแล้วให้แห้งระหว่างแผ่นกระดาษกรอง และถ่ายภาพเจลก่อนที่แถบจะแพร่กระจายจนเลือนหาย

จำประโยคสั้น ๆ สำหรับโต๊ะทดลองนี้ไว้: เจลตรวจว่ามองเห็นได้หรือไม่เมื่อใส่ตัวอย่างปริมาณมากภายใต้แสงขาว เมมเบรนตรวจการถ่ายโอนและการใส่ตัวอย่างก่อนที่โพรบจะทำหน้าที่ตรวจอย่างไว สีย้อมชนิดเดียวใช้ได้กับทั้งสองงาน โดยมีความไวไม่สูงนัก การจับแบบย้อนกลับได้ และลำดับขั้นตอนที่ต้องปฏิบัติอย่างเคร่งครัด