การสร้างกราฟสอบเทียบเมทิลีนบลู: แบลงก์ ช่วงความเข้มข้น และความเป็นเชิงเส้น

นักวิเคราะห์สองคนใช้สารละลายตั้งต้นเมทิลีนบลูจากขวดเดียวกัน และต่างคนต่างสร้างกราฟสอบเทียบ คนแรกได้เส้นตรงผ่านจุดกำเนิดและวัดตัวอย่างที่ไม่ทราบความเข้มข้นได้อย่างมั่นใจ คนที่สองได้เส้นที่โค้งบริเวณปลายบน จุดตัดแกนที่ไม่ใกล้ศูนย์ และผลตัวอย่างที่เปลี่ยนไปตามการเจือจาง สีย้อมเดียวกัน เครื่องมือเดียวกัน ความยาวคลื่นเดียวกัน ความแตกต่างไม่ได้อยู่ที่ทักษะ แต่อยู่ที่การออกแบบ: ใส่อะไรลงในแบลงก์ เลือกความเข้มข้นใดบ้าง และช่วงที่ตรวจสอบยังอยู่ภายในบริเวณที่แบบจำลองอย่างง่ายเพียงแบบเดียวยังใช้ได้หรือไม่

กราฟสอบเทียบเป็นข้อตกลงระหว่างการตอบสนองของเครื่องมือกับความเข้มข้น ซึ่งใช้ได้เฉพาะภายใต้สภาวะที่ใช้สร้างกราฟนั้น สำหรับเมทิลีนบลู ข้อตกลงนี้มีจุดอ่อนที่ทราบกันอยู่แล้ว สีย้อมรวมตัวกันเองในน้ำ ทำให้รูปแบบของสารที่ดูดกลืนแสงเปลี่ยนไปตามความเข้มข้น กราฟที่สร้างคร่อมช่วงการเปลี่ยนแปลงนี้จะไม่เป็นเส้นตรง และไม่ว่าจะใช้สถิติมากเพียงใดก็แก้ไม่ได้ บทความนี้แสดงวิธีออกแบบกราฟให้เส้นที่ได้มีความหมาย: เลือกแบลงก์ให้เหมาะสม จำกัดช่วงให้อยู่ในบริเวณที่โมโนเมอร์เป็นหลัก ทำการทดลองซ้ำอย่างตรงไปตรงมา และมองความโค้งเป็นข้อมูลแทนที่จะเป็นสัญญาณรบกวน

เริ่มจากแบลงก์ ไม่ใช่สารมาตรฐาน

แบลงก์เป็นตัวกำหนดค่าศูนย์ และสำหรับเมทิลีนบลู แบลงก์ต้องมีทุกอย่างยกเว้นสีย้อม ใช้น้ำเกรดเดียวกัน บัฟเฟอร์และ pH เดียวกัน เกลือชนิดและปริมาณเดียวกัน สัดส่วนตัวทำละลายร่วมเดียวกัน และอุณหภูมิเดียวกัน เตรียมสารมาตรฐานสอบเทียบในเมทริกซ์ที่เหมือนกันทุกประการ เหตุผลเป็นเรื่องเคมี ไม่ใช่ข้อกำหนดทางเอกสาร เกลือและตัวทำละลายเปลี่ยนสมดุลระหว่างโมโนเมอร์ ไดเมอร์ และกลุ่มรวมตัวที่มีขนาดใหญ่ขึ้น ซึ่งทำให้สเปกตรัมที่ความยาวคลื่นวัดเปลี่ยนไป แบลงก์ที่มีเพียงน้ำไม่สามารถชดเชยการเปลี่ยนแปลงรูปแบบทางเคมีที่เกิดจากเมทริกซ์ได้ การวิเคราะห์สเปกตรัมเมทิลีนบลูในน้ำแบบรวมทั้งชุด ซึ่งอ่านได้ผ่าน ระเบียนแบบเปิดให้เข้าถึง ปรับความเข้มข้นโซเดียมคลอไรด์จาก 0 ถึง 0.15 M เพราะความแรงไอออนิกทำให้สมดุลเปลี่ยนโดยตรง และการรวมตัวเพิ่มขึ้นเมื่อมีเกลือมากขึ้น

ผลในทางปฏิบัติข้อหนึ่งคือ อย่าสอบเทียบในน้ำปราศจากไอออนแล้วนำไปวัดตัวอย่างในบัฟเฟอร์ฟอสเฟตหรือน้ำเสียที่ผ่านการกรอง หากไม่มีเมทริกซ์ที่ปราศจากสารที่ต้องการวิเคราะห์ การเติมสารมาตรฐานลงในตัวอย่างโดยตรงย่อมเหมาะกว่าการใช้กราฟมาตรฐานภายนอกที่มีเมทริกซ์ไม่ตรงกัน แนวทางที่เกี่ยวข้องสำหรับรักษาความน่าเชื่อถือของการวิเคราะห์ในสารละลายน้ำอยู่ในหัวข้อเมทริกซ์และสารรบกวน ส่วนหลักการทั่วไปของการวิเคราะห์สีย้อมเชิงปริมาณอธิบายไว้ในภาพรวมการออกแบบการวิเคราะห์

เลือกช่วงที่มีรูปแบบสารชนิดเดียวเป็นหลัก

การวิเคราะห์เชิงปริมาณที่แถบความยาวคลื่นยาวใกล้ 664 nm ตั้งอยู่บนสมมติฐานว่าสีย้อมส่วนใหญ่เป็นโมโนเมอร์ ในน้ำล้วน สมมติฐานนี้ใช้ได้เฉพาะเมื่อสารละลายยังเจือจาง โดยคร่าว ๆ อยู่ในช่วง micromolar ระดับต่ำ ค่าความชันจากการทดลองที่ตีพิมพ์แสดงให้เห็นขอบเขตนี้: การสอบเทียบที่จำกัดความเข้มข้นไว้ต่ำกว่าประมาณ 7 micromolar ในเซลล์ 1 cm ให้ความชันใกล้ 82,000 M-1 cm-1 ขณะที่การสอบเทียบที่ขยายไปถึงประมาณ 37 micromolar ให้ค่าลดลงเหลือราว 67,100 เพราะสารมาตรฐานช่วงบนมีไดเมอร์ในปริมาณที่มีนัยสำคัญแล้ว สัมประสิทธิ์ทุกค่าที่อ้างถึงที่นี่มีการระบุสภาวะกำกับไว้ใน เอกสารอ้างอิงสเปกตรัมของเมทิลีนบลู ซึ่งเป็นแหล่งที่เหมาะสำหรับเปรียบเทียบตัวเลข บทความนี้ใช้ค่าเหล่านั้นเพื่อกำหนดช่วงเท่านั้น

หลักการออกแบบจึงเป็นดังนี้:

1. ให้สารมาตรฐานระดับสูงสุดเจือจางพอที่รูปร่างสเปกตรัมจะคงที่ ในระหว่างพัฒนาวิธี ให้สแกนตลอดช่วงแสงที่มองเห็นได้ (ประมาณ 550 ถึง 750 nm) สำหรับแต่ละระดับ แทนการอ่านเพียงความยาวคลื่นเดียว หากสเปกตรัมที่ปรับให้อยู่บนสเกลเดียวกันมีรูปร่างเปลี่ยนไปตามความเข้มข้น แสดงว่าเคมีกำลังเปลี่ยนและช่วงกว้างเกินไป
2. ติดตามอัตราส่วนค่าการดูดกลืนแสงใกล้ 610 nm ต่อค่าการดูดกลืนแสงใกล้ 665 nm ในแต่ละระดับ อัตราส่วนที่เพิ่มขึ้นตามความเข้มข้นหมายความว่าไหล่พีกของไดเมอร์กำลังสูงขึ้น และแบบจำลองโมโนเมอร์เริ่มใช้ไม่ได้ การตรวจวินิจฉัยนี้อธิบายเพิ่มเติมใน คู่มือผลของการรวมตัวและความเข้มข้น
3. ใช้เซลล์ 1 cm สำหรับงานในช่วง micromolar ระดับต่ำ เมื่อความชันใกล้ 82,000 ความเข้มข้น 5 micromolar ให้ค่าการดูดกลืนแสงใกล้ 0.41 และ 10 micromolar ให้ค่าประมาณ 0.82 ซึ่งทั้งสองค่าอยู่ในช่วงที่เครื่องมือส่วนใหญ่วัดได้สะดวก
4. สำหรับสารละลายตั้งต้นเข้มข้น ให้ลดความยาวทางเดินแสงแทนการยอมรับค่าการดูดกลืนแสงที่สูงกว่า 1 มาก แต่ต้องจำไว้ว่าทางเดินแสงสั้นแก้ปัญหาการวัดแสง ไม่ใช่ปัญหาเคมี การรวมตัวขึ้นอยู่กับความเข้มข้น ไม่ใช่ความยาวทางเดินแสง ดังนั้นสารละลายตั้งต้นเข้มข้นยังต้องใช้วิธีที่คำนึงถึงรูปแบบทางเคมีของสารโดยเฉพาะ แทนการใช้กราฟโมโนเมอร์เจือจาง

การฟิตข้อมูลแบบรวมทั้งชุดที่เป็นพื้นฐานของข้อสรุปส่วนใหญ่เหล่านี้ครอบคลุม 224 สเปกตรัม ตั้งแต่ 1.1 micromolar ถึง 3.4 millimolar และพบว่าสามารถตรวจพบสัญญาณของเททราเมอร์ได้แล้วที่ความเข้มข้นต่ำกว่า 34 micromolar ข้อค้นพบนี้เตือนให้ระวัง: ช่วงเชิงเส้นแคบกว่าที่คาดจากความรู้สึก จึงควรตรวจสอบแทนการตั้งสมมติฐานเอาเอง

ระดับความเข้มข้น การทดลองซ้ำ และลำดับการวัด

กราฟที่มีสามจุดไม่ได้พิสูจน์อะไร แนวทางการตรวจสอบความใช้ได้ใน ICH Q2(R2) กำหนดให้ใช้ความเข้มข้นอย่างน้อยห้าระดับเพื่อประเมินความเป็นเชิงเส้น และระดับที่ไม่ใช่ศูนย์หกถึงแปดระดับช่วยให้ได้กราฟสำหรับใช้งานที่น่าเชื่อถือกว่า โดยเฉพาะบริเวณช่วงบนที่เริ่มเกิดการรวมตัว จัดระดับให้ครอบคลุมช่วงตัวอย่างที่ต้องการ โดยเพิ่มความถี่ของจุดในบริเวณที่น่าจะเกิดความโค้งมากที่สุด ไม่ใช่เลือกเป็นลำดับเรขาคณิตเพียงเพื่อความสะดวก

วัดแต่ละระดับสองหรือสามซ้ำ โดยเตรียมแต่ละซ้ำอย่างอิสระ แทนการอ่านสามครั้งจากขวดเดียว การทดลองซ้ำที่เตรียมอย่างอิสระเผยให้เห็นความคลาดเคลื่อนในการเตรียม ส่วนการอ่านซ้ำจากขวดเดียวเผยให้เห็นเพียงสัญญาณรบกวนของเครื่องมือ การศึกษาแบบรวมทั้งชุดในปี 2020 วัดสารละลายแต่ละชุดสามครั้ง ซึ่งยังเป็นแนวทางเริ่มต้นที่เหมาะสม สุ่มลำดับการอ่านค่าเพื่อไม่ให้การเลื่อนของสัญญาณ การดูดซับบนแก้ว หรือการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิดูเหมือนความโค้งของกราฟ การศึกษาคิวเวตต์ควอตซ์พบว่าสีย้อมประมาณ 3 เปอร์เซ็นต์จากสารละลาย 34 micromolar ถูกดูดซับภายใน 10 นาที จึงควรรักษาเวลาสัมผัส คิวเวตต์ การทำความสะอาด และลำดับการวัดให้สม่ำเสมอตลอดชุดการวิเคราะห์

ตัวอย่างการคำนวณเพื่อประกอบคำอธิบาย (ไม่ใช่ข้อมูลที่วัดจริง)

ตัวเลขด้านล่างสมมติขึ้นเพื่อแสดงวิธีคำนวณ ไม่ใช่ผลการวัดในห้องปฏิบัติการ และต้องไม่นำไปอ้างเป็นข้อมูลเมทิลีนบลู สิ่งสำคัญคือรูปแบบการตรวจสอบที่ใช้กับตัวเลขเหล่านี้

สมมติว่ามีสารมาตรฐานหกระดับในบัฟเฟอร์ที่ตรงกัน ใช้ทางเดินแสง 1 cm อ่านค่าที่ 665 nm เทียบกับแบลงก์ที่มีเมทริกซ์ตรงกัน:

การฟิตเส้นตรงระหว่างค่าการดูดกลืนแสงเฉลี่ยกับความเข้มข้นให้ความชันใกล้ 0.0805 หน่วยการดูดกลืนแสงต่อ micromolar และจุดตัดแกนห่างจากศูนย์เพียงไม่กี่มิลลิหน่วยการดูดกลืนแสง การหารความชันด้วยความยาวทางเดินแสงแปลงค่าเป็นสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงปรากฏ: 0.0805 ต่อ micromolar เท่ากับประมาณ 80,500 M-1 cm-1 ซึ่งสอดคล้องกับช่วงที่มีโมโนเมอร์เป็นหลักในน้ำ สิ่งที่ต้องตรวจสอบไม่ใช่ค่า R กำลังสอง ซึ่งจะดูดีมากไม่ว่าอย่างไร แต่คือจุดตัดแกนที่ใกล้ศูนย์ อัตราส่วน A610/A665 ที่คงที่ตั้งแต่ S2 ถึง S5 และค่าคงเหลือที่กระจายโดยไม่มีแนวโน้ม อัตราส่วนที่เพิ่มขึ้นเล็กน้อยที่ S6 เป็นสัญญาณที่ควรยอมรับอย่างตรงไปตรงมา โดยอาจตัดระดับนั้นออก หรือระบุ 7 micromolar เป็นขอบเขตบนชั่วคราวสำหรับเมทริกซ์และเครื่องมือชุดนี้

ตัวอย่างที่ไม่ทราบความเข้มข้นซึ่งอ่านได้ 0.245 ภายใต้สภาวะเดียวกันสามารถแปลงค่าได้โดยตรง: 0.245 หารด้วย 0.0805 ต่อ micromolar ได้ประมาณ 3.0 micromolar ก่อนนำตัวคูณการเจือจางตัวอย่างมาใช้ รายงานผลพร้อมสภาวะที่ใช้ ได้แก่ ความยาวคลื่น ทางเดินแสง เมทริกซ์ของแบลงก์ ช่วงสอบเทียบ และวันที่

แบบบันทึกการสอบเทียบสำหรับกรอก

คัดลอกแม่แบบนี้ลงในบันทึกห้องปฏิบัติการสำหรับเมทริกซ์ใหม่แต่ละชนิด หนึ่งเมทริกซ์ หนึ่งแผ่น หนึ่งกราฟ

แถวรูปแบบรีเอเจนต์มีเหตุผลที่ต้องอยู่ในแบบบันทึก เมทิลีนบลูที่จำหน่ายอาจเป็นเกลือปราศจากน้ำหรือไฮเดรต เช่น ไตรไฮเดรต และการใช้มวลโมลาร์ผิดทำให้ความเข้มข้นที่กำหนดทุกค่าคลาดเคลื่อนไปอย่างเงียบ ๆ การตรวจสอบความบริสุทธิ์และข้อกำหนดของสารตั้งต้นอธิบายไว้ในคู่มือคุณภาพและเกรด

ตรวจยืนยันด้วยสารมาตรฐานตรวจสอบที่เตรียมอย่างอิสระ

กราฟสอบเทียบไม่ควรตรวจให้คะแนนตัวเอง หลังฟิตกราฟแล้ว ให้เตรียมสารมาตรฐานตรวจสอบหนึ่งชุดจากสารละลายตั้งต้นที่ชั่งเตรียมแยกต่างหาก โดยใช้ความเข้มข้นใกล้กึ่งกลางของช่วงที่ยอมรับ และวัดเสมือนเป็นตัวอย่างที่ไม่ทราบความเข้มข้น ผลที่ตรงกันภายในไม่กี่เปอร์เซ็นต์ยืนยันความถูกต้องของกระบวนการเตรียม หากไม่ตรงกัน ควรสงสัยสารละลายตั้งต้นหรือขั้นตอนการเจือจางมากกว่าเครื่องมือ วัดสารมาตรฐานตรวจสอบซ้ำในตัวอย่างทุกชุด หากค่าเปลี่ยนไปทั้งที่กราฟไม่เปลี่ยน ให้สงสัยสารละลายใช้งานหรือคิวเวตต์ก่อนสงสัยตัวอย่าง นิสัยเพียงข้อนี้ช่วยจับความผิดพลาดที่มักไม่แสดงสัญญาณชัดเจนได้ส่วนใหญ่: ใช้มวลโมลาร์ของไฮเดรตกับสารในขวดที่เป็นชนิดปราศจากน้ำ ไมโครปิเปตต์ที่คลาดจากการสอบเทียบ หรือบัฟเฟอร์ที่เตรียมด้วยความแรงไอออนิกผิด บันทึกค่าการคืนกลับของสารมาตรฐานตรวจสอบไว้ข้างความชันในแบบบันทึก เพื่อให้ผู้อ่านภายหลังเห็นว่าเส้นนั้นผ่านการทดสอบ ไม่ใช่เพียงวาดขึ้นมา

ตีความความไม่เป็นเชิงเส้นเพื่อวินิจฉัยสาเหตุ

เมื่อกราฟโค้ง รูปแบบความผิดปกติช่วยระบุสาเหตุได้ ความโค้งลงที่ค่าการดูดกลืนแสงสูงโดยรูปร่างสเปกตรัมไม่เปลี่ยนชี้ไปที่เครื่องมือ ซึ่งมักเกิดจากแสงเล็ดลอดทำให้ค่าการดูดกลืนแสงสูงถูกอ่านต่ำกว่าจริง ความโค้งที่มาพร้อมไหล่พีก 610 nm สูงขึ้นชี้ไปที่เคมี: ไดเมอร์และกลุ่มรวมตัวที่ใหญ่กว่าดูดกลืนแสงต่างจากโมโนเมอร์ แบลงก์ที่ปรับเป็นศูนย์ไม่ได้ หรือสารมาตรฐานที่ให้ค่าลดลงตามเวลา ชี้ไปที่ภาชนะ: การดูดซับบนแก้วหรือคิวเวตต์ โดยเฉพาะเมื่อเวลาสัมผัสต่างกันตลอดชุดการวัด ส่วนเส้นตรงที่ผ่านจุดต่าง ๆ ได้ดีแต่ยังให้ผลตัวอย่างผิด ชี้ไปที่เมทริกซ์: ตัวอย่างต่างจากสารมาตรฐานสอบเทียบ จึงต้องสร้างกราฟใหม่ในเมทริกซ์ของตัวอย่าง หรือเปลี่ยนไปใช้วิธีเติมสารมาตรฐาน ในทุกกรณีให้พล็อตค่าคงเหลือเทียบกับความเข้มข้น การกระจายแบบสุ่มสนับสนุนแบบจำลองเส้นตรง ส่วนรูปโค้งหงายหรือคว่ำหักล้างแบบจำลองได้อย่างน่าเชื่อถือกว่าเกณฑ์ค่า R กำลังสองใด ๆ ซึ่งเป็นประเด็นที่แนวทางการตรวจสอบความใช้ได้รับรองไว้อย่างชัดเจน

เมทิลีนบลูให้ผลที่น่าเชื่อถือเมื่อปฏิบัติอย่างมีวินัยเช่นนี้ แถบโมโนเมอร์มีความเข้มสูง เคมีของสารนี้ได้รับการศึกษาไว้อย่างละเอียด และรูปแบบความผิดปกติจะแสดงตัวในสเปกตรัมก่อนทำให้ตัวเลขผิดเพี้ยน สร้างกราฟในช่วงแคบ ใช้แบลงก์ให้ตรงกับสภาวะจริง เตรียมการทดลองซ้ำอย่างอิสระ และให้รูปร่างสเปกตรัมเป็นตัวช่วยตัดสินช่วงที่ใช้ เส้นที่ได้อาจสั้น แต่ทุกจุดบนเส้นนั้นเชื่อถือได้

การคำนวณประกอบคำอธิบายในบทความนี้ใช้ตัวเลขสมมติเพื่อสาธิตวิธี สัมประสิทธิ์อ้างอิงที่วัดจริงพร้อมสภาวะครบถ้วนอยู่ในเอกสารอ้างอิงสเปกตรัมที่เชื่อมโยงไว้ และการศึกษาการรวมตัวที่เป็นพื้นฐานมีระเบียนที่ PMID 33251415.