เมทิลีนบลูกับไบโอฟิล์ม: การศึกษาในห้องปฏิบัติการที่ใช้แสงกระตุ้นวัดอะไร

ไบโอฟิล์มไม่ใช่กลุ่มเซลล์ที่ลอยอยู่ในของเหลว แต่เป็นโครงสร้างที่ประกอบด้วยเซลล์ซึ่งยึดเกาะกับพื้นผิวและฝังตัวอยู่ในเมทริกซ์ที่สร้างขึ้นเองจากพอลิแซ็กคาไรด์ โปรตีน และ DNA นอกเซลล์ โดยมีระดับออกซิเจนและสารอาหารไล่ลดหลั่นจากภายนอกสู่ภายใน โครงสร้างนี้เป็นเหตุผลที่สารซึ่งฆ่าแบคทีเรียแขวนลอยได้ภายในไม่กี่นาทีอาจไม่ได้ผลกับจุลินทรีย์ชนิดเดียวกันที่เติบโตเป็นฟิล์ม ข้อกล่าวอ้างใด ๆ เกี่ยวกับเมทิลีนบลูและไบโอฟิล์มจึงต้องอ่านโดยคำนึงถึงโครงสร้างนี้ เพราะเมทริกซ์เป็นตัวกำหนดว่าสีย้อมจะเข้าถึงเซลล์ได้มากเพียงใด และแสงจะเข้าถึงสีย้อมได้มากเพียงใด

บททบทวนนี้ครอบคลุมแหล่งข้อมูลเพียงสามแหล่ง แหล่งหนึ่งให้ข้อมูลพื้นฐาน อีกสองแหล่งเป็นการทดลองในห้องปฏิบัติการ การแยกบทบาทเหล่านี้ออกจากกันคือหลักการทั้งหมดของการทบทวน และช่วยป้องกันข้อผิดพลาดที่พบบ่อยที่สุดในหัวข้อนี้ นั่นคือการอ้างผลจากจานทดลองราวกับเป็นหลักฐานสำหรับการรักษาการติดเชื้อในคน

แหล่งข้อมูลพื้นฐานกล่าวถึงเคมี ไม่ใช่การฆ่าเชื้อ

แหล่งข้อมูลที่เก่าที่สุดในสามแหล่งคือ บททบทวนเชิงบรรยายเกี่ยวกับการพัฒนาสารไวแสงกลุ่มฟีโนไทอะซิเนียม ซึ่งเผยแพร่ในปี 2005 บททบทวนนี้ติดตามพัฒนาการของเมทิลีนบลูจากสีย้อมในศตวรรษที่ 19 มาเป็นสารต้นแบบสำหรับการบำบัดมะเร็งด้วยโฟโตไดนามิก และต่อมาสำหรับเคมีบำบัดต้านจุลชีพด้วยโฟโตไดนามิก สิ่งที่บททบทวนนี้ให้คือเรื่องราวความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างกับฤทธิ์: การเติมหมู่เมทิลให้โครโมฟอร์เพิ่มความชอบไขมัน ผลได้ของออกซิเจนสถานะซิงเกล็ต และความสามารถในการฆ่าแบคทีเรียเมื่อกระตุ้นด้วยแสง ขณะเดียวกันก็ชะลอการรีดิวซ์ไปเป็นรูปแบบลิวโคที่มีฤทธิ์น้อยกว่า บททบทวนยังระบุปัญหาของวงการนี้ไว้อย่างตรงไปตรงมา รายงานส่วนใหญ่ใช้สีย้อมเชิงพาณิชย์ทั่วไป โดยมีการพัฒนาอนุพันธ์ค่อนข้างน้อย

ใช้บททบทวนนี้สำหรับส่วนที่อธิบายกลไกในกรอบความเข้าใจของคุณ: แสงกระตุ้นสีย้อม สถานะทริปเล็ตทำปฏิกิริยากับออกซิเจนผ่านการถ่ายโอนพลังงานแบบ Type II เพื่อสร้างออกซิเจนสถานะซิงเกล็ต หรือผ่านการถ่ายโอนอิเล็กตรอนแบบ Type I เพื่อสร้างอนุมูล และการโจมตีที่อาศัยหลายปัจจัยนี้เป็นเหตุผลที่กลไกการดื้อแบบทั่วไปใช้รับมือการฆ่าด้วยโฟโตไดนามิกได้ไม่ดีนัก อย่าอ้างบททบทวนนี้เพื่อสนับสนุนค่าการลดลงแบบ log เพราะไม่ได้วัดค่านั้น เคมีแสงในภาพรวมที่อยู่เบื้องหลังกลไกนี้อธิบายไว้ในชุดรวบรวมหลักฐานด้านการบำบัดด้วยโฟโตไดนามิก ส่วนหลักเกณฑ์ด้านความยาวคลื่นที่กำหนดว่าหลอดไฟชนิดหนึ่งจะกระตุ้นกลไกนี้ได้หรือไม่ อธิบายไว้ใน เมทิลีนบลูดูดกลืนแสงสีแดงอย่างไร

การทดลองไบโอฟิล์มสองฉบับ แนวคิดของผลลัพธ์สองแบบ

งานทดลองทั้งสองฉบับทดสอบการออกฤทธิ์โฟโตไดนามิกของเมทิลีนบลูกับไบโอฟิล์มในช่องปากที่ 660 nm แต่แทบไม่มีสิ่งอื่นตรงกัน ทั้งชุมชนจุลินทรีย์ อายุ สูตรสีย้อม ปริมาณแสง และเหนือสิ่งอื่นใดคือตัวชี้วัดผล ล้วนแตกต่างกัน ความแตกต่างนี้คือประเด็นหลักของบทความ และเป็นสาระของตารางเปรียบเทียบที่จัดทำขึ้นด้านล่างด้วย

ฉบับแรกคือ การศึกษาไบโอฟิล์มใต้เหงือกหลายสปีชีส์ที่เจริญเต็มที่ในหลอดทดลอง ซึ่งเผยแพร่ในปี 2024 นักวิจัยเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์ 33 สปีชีส์ร่วมกันบนหมุดพอลิสไตรีนในอุปกรณ์ Calgary Biofilm Device ให้อาหารภายใต้สภาวะไร้ออกซิเจน เปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อหลัง 72 ชั่วโมง และเพาะเลี้ยงต่อจนครบระยะเวลาที่กำหนดไว้ 7 วัน การทดลองใช้เมทิลีนบลูแบบอิสระที่ความเข้มข้น 0.01 เปอร์เซ็นต์ ร่วมกับ LED สีแดง 660 nm ที่ความเข้มรังสีประมาณ 330 mW per square cm เป็นเวลา 5 นาที ที่ระยะห่าง 2 mm ซึ่งคำนวณได้เป็นปริมาณแสงประมาณ 99 J per square cm การออกแบบเป็นแบบแฟกทอเรียลที่ชัดเจน โดยมีสี่กลุ่ม ได้แก่ กลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับการจัดการ สีย้อมโดยไม่มีแสง แสงโดยไม่มีสีย้อม และสีย้อมร่วมกับแสง

ฉบับที่สองคือ การศึกษาไบโอฟิล์มในช่องปากของจุลินทรีย์ที่เข้ามาตั้งรกรากระยะแรกในหลอดทดลอง ซึ่งเผยแพร่ในปี 2021 นักวิจัยเพาะเลี้ยง Streptococcus สี่สปีชีส์ร่วมกันเป็นเวลา 24 ชั่วโมงในเพลต 96 หลุม โดยมีซูโครส 1 เปอร์เซ็นต์ สารไวแสงคือเมทิลีนบลูที่เชื่อมกับอนุภาคนาโนเบตาไซโคลเดกซ์ทรินที่ความเข้มข้น 4.65 micromolar เป็นสูตรนำส่งที่ออกแบบให้พาสีย้อมผ่านสิ่งกีดขวางของไบโอฟิล์ม แหล่งแสงทั้งสองเป็นแสงสีแดงที่ 660 nm และฉายแสงเป็นเวลา 90 วินาที แต่ปริมาณแสงต่างกันอย่างมาก: 320 J per square cm สำหรับกลุ่มเลเซอร์ และ 8.1 J per square cm สำหรับกลุ่ม LED กลุ่มควบคุมประกอบด้วยสีย้อมโดยไม่มีแสง เลเซอร์เพียงอย่างเดียว LED เพียงอย่างเดียว น้ำเกลือเป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ และคลอร์เฮกซิดีน 0.2 เปอร์เซ็นต์เป็นสารต้านจุลชีพอ้างอิง

ชุมชนจุลินทรีย์ไร้ออกซิเจน 33 สปีชีส์ อายุ 7 วัน กับไบโอฟิล์มของจุลินทรีย์ที่เข้ามาตั้งรกรากระยะแรก 4 สปีชีส์ อายุ 24 ชั่วโมง เป็นระบบการวัดที่แตกต่างกัน ตัวเลขต่อไปนี้จึงนำมาเฉลี่ยรวมกันไม่ได้

แต่ละการศึกษาวัดอะไรจริง ๆ

ในการศึกษาไบโอฟิล์มที่เจริญเต็มที่ ตัวชี้วัดผลคือกิจกรรมเมแทบอลิซึมจากการรีดิวซ์ TTC โดยอ่านค่าที่ 485 nm และปริมาณแบคทีเรียจากการไฮบริไดเซชัน DNA–DNA แบบเชกเกอร์บอร์ดด้วยโพรบสำหรับทั้ง 33 สปีชีส์ โดยมีขีดจำกัดการตรวจพบใกล้เคียง 10,000 เซลล์ ไม่มีการเพาะบนเพลตเพื่อนับจุลินทรีย์ที่มีชีวิต ไม่มีการวัดมวลชีวภาพด้วยคริสตัลไวโอเลต ไม่มีการถ่ายภาพแยกเซลล์มีชีวิตและเซลล์ตาย และไม่มีการติดตามการเจริญกลับมาใหม่ LED เพียงอย่างเดียวลดกิจกรรมเมแทบอลิซึมประมาณ 50 เปอร์เซ็นต์เมื่อเทียบกับกลุ่มที่ไม่ได้รับ LED ส่วนสีย้อมร่วมกับ LED ลดกิจกรรมดังกล่าวประมาณ 55 เปอร์เซ็นต์ กลุ่มสีย้อมเพียงอย่างเดียวอยู่ในกลุ่มทางสถิติเดียวกับกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับการจัดการ สำหรับจำนวนที่คำนวณจาก DNA กลุ่มสีย้อมเพียงอย่างเดียว LED เพียงอย่างเดียว และสีย้อมร่วมกับ LED ล้วนมีค่าต่ำกว่ากลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ โดยไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างทั้งสามกลุ่ม ผู้เขียนระบุข้อสรุปโดยตรงว่า การจัดการเหล่านี้ไม่ได้ทำลายไบโอฟิล์มหลายจุลชีพที่ก่อตัวและยึดเกาะแล้ว และไบโอฟิล์มปริทันต์ที่เจริญเต็มที่จำเป็นต้องใช้วิธีเชิงกลรบกวนโครงสร้าง โดยโฟโตไดนามิกเป็นได้อย่างมากเพียงวิธีเสริม

ในการศึกษาจุลินทรีย์ที่เข้ามาตั้งรกรากระยะแรก ตัวชี้วัดผลคือจุลินทรีย์ที่มีชีวิตซึ่งเพาะกลับได้บนอาหารเลี้ยงเชื้อแบบคัดเลือก โดยแสดงผลบนมาตราส่วนลอการิทึม กลุ่มสีย้อมโดยไม่มีแสงไม่แตกต่างจากน้ำเกลือ ทั้งสองกลุ่มที่กระตุ้นด้วยแสง ได้แก่ เลเซอร์ร่วมกับสีย้อมที่ห่อหุ้ม และ LED ร่วมกับสีย้อมที่ห่อหุ้ม ลดจำนวนจุลินทรีย์ที่มีชีวิตได้สูงสุดประมาณ 4 log เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมเชิงลบ เท่ากับลดลง 10,000 เท่า หรือ 99.99 เปอร์เซ็นต์ตามตัวชี้วัดนี้ และทั้งสองกลุ่มไม่แตกต่างจากคลอร์เฮกซิดีนในทางสถิติ ค่าแสงเพียงอย่างเดียวและสีย้อมในสภาวะมืดไม่ได้รายงานเป็นตัวเลข log แยกที่เชื่อถือได้ ดังนั้นข้อสรุปที่ตรงไปตรงมาจึงต้องจำกัดอยู่ที่สิ่งที่งานวิจัยสนับสนุน: สีย้อมที่ห่อหุ้มและกระตุ้นด้วยแสงทำให้จำนวนลดลง สีย้อมในสภาวะมืดไม่ทำให้ลดลง และขนาดการลดลงเทียบเคียงได้กับสารฆ่าเชื้ออ้างอิงในแบบจำลองไบโอฟิล์มอายุน้อยนี้

ไม่มีงานวิจัยฉบับใดวัดการเจริญกลับมาใหม่หลังการจัดการ มวลชีวภาพที่เหลืออยู่ หรือโครงสร้างเมทริกซ์ การลดลงของ CFU ไม่ได้บอกอะไรเกี่ยวกับเมทริกซ์ที่เหลืออยู่ การลดลงของเมแทบอลิซึมไม่ได้บอกอะไรเกี่ยวกับจุลินทรีย์ที่รอดชีวิต การนับจาก DNA ไม่สามารถบอกได้ว่าเซลล์ใดยังมีชีวิต

การเปรียบเทียบวิธีทดสอบและตัวชี้วัดผล

ตารางนี้เป็นเครื่องมือเปรียบเทียบสำหรับบทความ อ่านตามแนวนอนเพื่อดูว่าการศึกษาหนึ่งฉบับพิสูจน์อะไร และอ่านตามแนวตั้งเพื่อดูว่าคำถามใดที่ทั้งสองการศึกษายังไม่ได้ตอบ

มีความแตกต่างสามประการที่ควรเน้น ประการแรก ในแบบจำลองที่เจริญเต็มที่ กลุ่มแสงเพียงอย่างเดียวอธิบายผลต่อเมแทบอลิซึมได้เกือบทั้งหมด ดังนั้นตัวเลข 55 เปอร์เซ็นต์จึงไม่ใช่การฆ่าเชื้อที่เกิดจากสีย้อม ประการที่สอง ในแบบจำลองอายุน้อย สูตรสีย้อมในสภาวะมืดไม่มีผล และผลปรากฏเฉพาะเมื่อมีแสง ซึ่งเป็นลักษณะบ่งชี้ของการกระตุ้นด้วยแสง ประการที่สาม การลดลง 80 เปอร์เซ็นต์ของจำนวนที่คำนวณจาก DNA จะใกล้เคียง 0.7 log ในทางคณิตศาสตร์ก็ต่อเมื่อตัวแปรนั้นเป็นจำนวนจุลินทรีย์ที่มีชีวิต แต่ในที่นี้ไม่ใช่ จึงต้องไม่อ้างเป็นค่าการฆ่าเชื้อแบบ log บริบทเกี่ยวกับไบโอฟิล์มทางทันตกรรมรวบรวมไว้ในหัวข้อไบโอฟิล์มในช่องปากและงานวิจัยทางทันตกรรม ส่วนวิธีทั่วไปสำหรับแยกแบบจำลอง เส้นทางการให้สาร และตัวชี้วัดผลระหว่างการศึกษาต่าง ๆ อธิบายไว้อย่างละเอียดใน คู่มือวิธีการทางห้องปฏิบัติการ

เหตุใดการศึกษาไบโอฟิล์มจึงต้องมีหลักเกณฑ์การอ่านเฉพาะ

ตัวแปรสี่ประการเป็นตัวกำหนดว่าผลการศึกษาเมทิลีนบลูกับไบโอฟิล์มจะมีความหมายเกินกว่าจานทดลองของการศึกษานั้นหรือไม่

ประการแรกคืออายุและเมทริกซ์ของไบโอฟิล์ม ฟิล์มที่มีอายุมากกว่าจะหนากว่า มีการเชื่อมขวางมากกว่า และสีย้อมแทรกซึมได้ยากกว่า ผู้เขียนงานวิจัยปี 2021 ระบุว่าการแทรกซึมและการแพร่ผ่านของแสงที่ไม่ดีในไบโอฟิล์มที่จัดตัวเป็นโครงสร้างคือข้อจำกัดหลัก กลยุทธ์การใช้ตัวพา เช่น การห่อหุ้มด้วยไซโคลเดกซ์ทริน เป็นความพยายามแก้ข้อจำกัดนี้โดยตรง นี่จึงเป็นเหตุผลที่สูตรสารเป็นตัวแปรในการทดลอง ไม่ใช่เพียงรายละเอียดปลีกย่อย

ประการที่สองคือการคำนวณปริมาณแสง ค่าฟลูเอนซ์ในที่นี้ต่างกันเกือบสี่สิบเท่า ตั้งแต่ 8.1 ถึง 320 J per square cm ที่ความยาวคลื่นเดียวกัน และความเข้มรังสีมีตั้งแต่ 90 mW ไปจนถึงหลาย W per square cm ความยาวคลื่นเดียวกันไม่ได้หมายถึงการได้รับแสงเท่ากัน และไม่มีการศึกษาใดปรับปริมาณแสงอย่างเป็นระบบมากพอที่จะกำหนดเส้นโค้งความสัมพันธ์ได้

ประการที่สามคือกลุ่มควบคุม การศึกษาที่ไม่มีกลุ่มสีย้อมในสภาวะมืดไม่สามารถตัดความเป็นพิษของสารเองออกได้ และการศึกษาที่ไม่มีกลุ่มแสงเพียงอย่างเดียวไม่สามารถระบุว่าผลใดเกิดจากการกระตุ้นด้วยแสง งานวิจัยทั้งสองฉบับมีกลุ่มควบคุมทั้งสองแบบ ซึ่งเป็นจุดแข็งของงานเหล่านี้ และงานวิจัยไบโอฟิล์มที่เจริญเต็มที่แสดงให้เห็นว่าเหตุใดกลุ่มแสงเพียงอย่างเดียวจึงสำคัญ: หากไม่มีกลุ่มนี้ ผลด้านเมแทบอลิซึมจะถูกอ่านว่าเป็นผลของสีย้อม

ประการที่สี่คือตัวชี้วัดผล ความมีชีวิต เมแทบอลิซึม ปริมาณ DNA มวลชีวภาพ โครงสร้าง และการเจริญกลับมาใหม่ เป็นข้อสรุปที่แตกต่างกันหกแบบ ไม่มีงานวิจัยในที่นี้วัดมากกว่าสองแบบ โดยเฉพาะการเจริญกลับมาใหม่ที่ไม่มีการวัดในทุกการศึกษา ดังนั้นความคงอยู่ของผลจึงเป็นสิ่งที่ยังไม่ได้วัด ไม่ใช่สิ่งที่แสดงให้เห็นแล้ว

สิ่งที่งานเหล่านี้ยังไม่ได้ยืนยันเกี่ยวกับการรักษาการติดเชื้อ

ระบบทดลองเหล่านี้ไม่มีการไหลเวียนเลือด เซลล์ภูมิคุ้มกัน การไหลของน้ำลาย การหมุนเวียนของของเหลวในร่องเหงือก หรือการกำจัดคราบด้วยวิธีเชิงกล ความเข้มข้นของสีย้อมในหลุมทดลองไม่ใช่ความเข้มข้นในเนื้อเยื่อหลังให้สารแก่คนผ่านเส้นทางใด ๆ การฉายแสงครั้งเดียวเป็นเวลา 5 นาทีหรือ 90 วินาทีต่อไบโอฟิล์มในห้องปฏิบัติการที่อายุน้อยหรือแม้แต่เจริญเต็มที่แล้ว ไม่ใช่หลักสูตรการรักษา ผู้เขียนงานวิจัยไบโอฟิล์มที่เจริญเต็มที่กล่าวเช่นนี้เอง โดยวางกรอบให้โฟโตไดนามิกเป็นวิธีที่อาจใช้เสริมการกำจัดด้วยวิธีเชิงกล แทนที่จะเป็นวิธีกำจัดให้หมดด้วยตัวเอง

ข้อสรุปที่ถูกต้องมีขอบเขตแคบและยังใช้ได้โดยไม่กล่าวเกินหลักฐาน เมทิลีนบลูที่กระตุ้นด้วยแสงสามารถลดเมแทบอลิซึมและปริมาณที่คำนวณจาก DNA ในชุมชนจุลินทรีย์ช่องปากที่เจริญเต็มที่ในห้องปฏิบัติการได้โดยไม่ทำลายชุมชนนั้น และในระบบทดลองดังกล่าว แสงเพียงอย่างเดียวเป็นสาเหตุหลักของผลต่อเมแทบอลิซึม สีย้อมที่นำส่งด้วยไซโคลเดกซ์ทรินและกระตุ้นด้วยแสงสามารถลดจำนวนจุลินทรีย์ที่มีชีวิตลงได้หลายลำดับขนาดในไบโอฟิล์มสเตรปโตค็อกคัสอายุน้อยในห้องปฏิบัติการ โดยมีขนาดผลเทียบเคียงกับคลอร์เฮกซิดีนในแบบจำลองเดียวกัน ข้อสังเกตใดข้อสังเกตหนึ่งจะประยุกต์ใช้กับการติดเชื้อในคนได้หรือไม่นั้นขึ้นอยู่กับการนำส่งสาร การเข้าถึงของแสง ออกซิเจน กายวิภาค และตัวชี้วัดผลทางคลินิก ซึ่งการทดลองเหล่านี้ไม่ได้ออกแบบมาเพื่อวัดตั้งแต่ต้น