Чӣ гуна кабуди метиленӣ ба ҳуҷайраҳо ворид мешавад: барқароршавӣ, оксидшавии такрорӣ ва воридшавӣ

Агар воридшавии кабуди метилениро ба ҳуҷайраҳои эндотелӣ дар зарфи парваришӣ мушоҳида кунед, хулосаи зоҳиран равшан ҳамон хулосаи нодуруст хоҳад буд. Муҳит ранги кабуди худро гум мекунад, дар ҳуҷайраҳо доначаҳои кабуд пайдо мешаванд, пас гӯё рангкунанда аз мембрана дар шакли молекулаи кабуд гузаштааст. Озмоишҳо чизи дигарро нишон медиҳанд. Шакли кабуд қариб намегузарад. Он чизе, ки мегузарад, шакли беранг аст; ранги кабуде, ки дар дохил мебинед, пас аз воридшавӣ дар ҳамон ҷо пайдо мешавад.

Ин баръакси тасаввури аввал будани раванд муҳим аст, зеро муайян мекунад, ки ранггирӣ чиро нишон дода метавонад ва чиро не. Доначаҳои кабуд аз рангкунандаи оксидшуда шаҳодат медиҳанд, ки дубора оксид шуда, дар органеллаҳо нигоҳ дошта шудааст. Онҳо миқдори умумии рангкунанда дар ҳуҷайраро нишон намедиҳанд, аз захираи шакли барқароршуда хабар намедиҳанд ва таъсири биологиро намесанҷанд. Барои фаҳмидани сабаб, се марҳиларо пайгирӣ кунед: барқароршавӣ дар сатҳ, диффузияи шакли барқароршуда, оксидшавии такрорӣ ва нигоҳдорӣ дар дохил.

Ду шакл мисли молекулаҳои гуногун рафтор мекунанд

Кабуди метилении оксидшуда сохтори ҳалқавии ҳамвор бо заряди мусбат аст. Он дар об ҳал мешавад, рӯшноиро дар ҳудуди тақрибан 600 то 700 нанометр сахт ҷаббида мегирад ва кабуд менамояд. Нуктаи асосӣ заряд аст. Молекулаи зарядноки обдӯст аз мембранаи липидӣ ба осонӣ намегузарад, бинобар ин дар адабиёти илмӣ онро бо эҳтиёт нисбатан аз мембрана нагузаранда меноманд, на комилан нагузаранда.

Кабуди метилении барқароршуда, ки лейкометилени кабуд ном дорад, беранг, безаряд ва дар чарб ҳалшаванда аст. Бо бартараф шудани заряд, мембрана дигар девор намемонад. Молекулаи барқароршуда ба осонӣ тавассути диффузия мегузарад ва баъди ворид шудан ба бахши дорои муҳити бештар оксидкунанда метавонад боз электронҳояшро аз даст диҳад ва ба шакли кабуд, заряднок ва дар дохил нигоҳдошташаванда баргардад. Аз ин рӯ, химияи оксиду барқароршавии рангкунанда ҳамзамон механизми интиқоли он низ мебошад. Шумораи электронҳоро тағйир диҳед — гузаронандагӣ ҳам тағйир меёбад.

Электронҳои марҳилаи аввал аз худи ҳуҷайра меоянд. Ҳуҷайраҳои ширхӯрон электронҳоро аз мембранаи плазмавӣ интиқол дода, эквивалентҳои барқароркунандаро аз донорҳои дохилиҳуҷайравӣ ба қабулкунандаҳои сатҳӣ мебаранд. Ин фаъолияти интиқолӣ аз мембранаи плазмавӣ вазифаи муқаррарии ҳуҷайра буда, дар аксари навъҳои ҳуҷайраҳо мавҷуд аст. Редуктазаи сатҳи эндотелӣ, ки бо рангкунандаҳои тиазинӣ кор мекунад, дар як ҷиҳати муҳим ба редуктазаҳои дигар монанд аст: дар ҳузури сианид ва азид бо вояҳое, ки марҳилаҳои баъдиро бозмедоранд, ҳамоно фаъол мемонад. Тамоми шарҳ ба ҳамин ҷудошавии марҳилаҳо такя мекунад.

Аввал тақсимшавӣ омӯхта шуд ва он қариб воридшавиро шарҳ дод

Соли 1929 Мариан Ирвин аз Институти Рокфеллер саволи содатаре гузошт. Шояд воридшавии рангкунанда танҳо тақсимшавии он байни об ва қабатҳои чарбии ҳуҷайра бошад ва дар озмоишгоҳ қабати хлороформ ҷойи он қабатҳои чарбиро гирифта тавонад. Дар таҳқиқоти спектрофотометрии нуфузпазирии худ ӯ маҳлулҳои обии рангкунандаро бо хлороформ такон дода, он чизеро, ки ба фазаи органикӣ мегузашт, бо он чизе, ки ба ҳуҷайраҳои зиндаи обсабз ворид мешуд, муқоиса кард.

Ду натиҷаи он кор то ҳол сазовори таваҷҷуҳанд. Аввал, маҳлулҳои тиҷоратии кабуди метиленӣ триметилтионин доштанд, ки ҳоло azure B номида мешавад. Ин омехта назар ба худи кабуди метиленӣ зудтар ворид мешуд, махсусан дар pH-и ишқорӣ, ки шакли асоси озоди дар липид ҳалшаванда бартарӣ дорад. Баъзе ҳолатҳои зоҳиран воридшавии кабуди метиленӣ дар асл воридшавии интихобии azure B буданд. Дуюм, pH бо муайян кардани ҳолати ионизатсия натиҷаро муайян мекард ва ҳуҷайраҳои осебдида назар ба ҳуҷайраҳои солим хеле бештар рангкунандаро роҳ медоданд. Коэффисиентҳои тақсимшавӣ ва ҳолати заряд муайян мекарданд, ки низоми сунъӣ ва ҳуҷайраи зинда ҳар кадом чиро ҷаббида мегиранд. Монандии ин ду натиҷа андешаи мавҷудияти қабатҳои ғайриобиро дар сарҳади ҳуҷайра дастгирӣ мекард.

Ин модел аҳамияти липидҳо ва ионизатсияро пешбинӣ карда буд, аммо рангкунандаеро, ки бе тағйири химиявӣ тақсим мешавад, аз рангкунандае фарқ карда наметавонист, ки дар сатҳ химиявӣ табдил меёбад, дар шакли дигар мегузарад ва дар дохил ба шакли пешина бармегардад. Барои муайян кардани ин фарқият озмоиши дигар лозим буд ва он пас аз ҳафтод сол дар эндотелии шуш гузаронида шуд.

Барқароршавӣ дар берун, нигоҳдорӣ дар дохил

Меркер ва ҳамкоронаш бо ҳуҷайраҳои эндотелии парваришшудаи шараёни шуши гов кор карда, пайдарҳамии се марҳиларо пешниҳод карданд: рангкунандаи оксидшуда дар сатҳи ҳуҷайра ба шакли беранги липофилии худ барқарор мешавад, шакли барқароршуда тавассути диффузия ворид мегардад ва оксидшавии такрории дохилиҳуҷайравӣ шакли оксидшудаи аз мембрана нагузарандаро аз нав ҳосил мекунад, ки ҷамъ мешавад. Сипас таҳқиқоти воридшавии тиазинҳо ба эндотелий ин пайдарҳамиро бо кӯшиши қатъ кардани он дар нуқтаҳои мушаххас санҷид.

Воситаи аввал феррисианид буд — қабулкунандаи электрон, ки ба ҳуҷайра ворид шуда наметавонад. Вақте ферментҳои сатҳӣ рангкунандаи кабудро берун аз ҳуҷайра ба шакли беранги он барқарор мекунанд, феррисианид метавонад он электронҳоро бозпас гирад ва пеш аз гузаштани рангкунанда аз мембрана шакли кабуди онро дар муҳит аз нав ҳосил кунад. То замоне ки феррисианид барзиёд буд (10 микромоляр рангкунанда дар муқобили 50 то 500 микромоляр феррисианид), воридшавии рангкунанда қариб қатъ мешуд. Танҳо пас аз сарф шудани феррисианид воридшавӣ бо суръати муқаррарии худ аз нав оғоз меёфт. Кинетика ҳамин равандро ба тарзи дигар ҳам нишон дод. Феррисианид бо суръати тақрибан доимӣ кам мешуд, ки ба ҷараёни устувори барқароршавии сатҳӣ, ки миёнарави дар давр гардишкунандаро таъмин мекунад, мувофиқ буд. Дар айни замон, рангкунандаи берун аз ҳуҷайра бо кам шудани захираи худ ба таври экспоненсиалӣ кам мешуд. Ҷараёни доимӣ дар баробари захираи камшаванда маънои онро дорад, ки сигнали феррисианид барқароршавии пайвастаро нишон медиҳад, на аз маҳлул хориҷ шудани молекулаҳои рангкунандаро.

Воситаи дуюм марҳилаи гузаштан аз мембранаро тамоман бартараф кард. Гурӯҳ толуидини кабуди O-ро, ки хеши наздики тиазинӣ аст, ба занҷири калони полиакриламид пайваст кард. Ин занҷир он қадар калон буд, ки дар ҳеҷ яке аз ҳолатҳои оксидшавӣ ба ҳуҷайра ворид шуда наметавонист. Ҳуҷайраҳо рангкунандаи пайвастшударо ҳамоно барқарор мекарданд. Пас, барои барқароршавӣ дастрасӣ ба дохили ҳуҷайра лозим нест. Дастгоҳи ин раванд дар сатҳ ҷойгир аст ё бо он алоқаи барқӣ дорад.

Баъдан ҷудошавии марҳилаҳое нишон дода шуд, ки унвони мақола ба он ишора мекунад. Сианид ва азид дар консентратсияи 2 миллимоляр ҷамъшавии рангкунандаро сахт коҳиш доданд ва зери микроскоп зарраҳои дохилии кабуди тира ва бунафш, ки одатан гирди ҳаста ҷой мегирифтанд, қариб нопадид шуданд. Аммо ҳеҷ яке аз ин боздорандаҳо барқароршавии берун аз ҳуҷайраро суст накард: гардиши феррисианид бе коҳиш идома ёфт ва полимери аз мембрана нагузаранда ҳамоно барқарор мешуд. Монеа дар марҳилаи баъдӣ буд. Сианид ва азид оксидшавии такрорӣ ва ҷудо нигоҳ доштани дохилиҳуҷайравиро бозмедоштанд, на барқароршавии сатҳиро. Санҷишҳои назоратии зиндамонии ҳуҷайраҳо ин тафсирро дастгирӣ карданд: дар давоми ин таъсирҳо ҳуҷайраҳо ферменти нишондиҳандаи ситозолии худ — лактатдегидрогеназаро — нигоҳ доштанд. Аз ин рӯ, аз байн рафтани воридшавӣ танҳо натиҷаи заҳролудшавӣ ё кандашавии мембрана набуд.

Як огоҳии мақола ҳанӯз ҳам эътибор дорад. Зарраҳои кабуд дар атрофи ҳаста буданд, на дар дохили он. Ин бо оксидшавӣ дар дохили органеллаҳои ҳуҷайра мувофиқ аст, аммо таҳқиқот муайян накард, ки кадом органеллаҳо иштирок мекунанд. Намунаҳои монандро дар навъҳои дигари ҳуҷайраҳо бо далелҳои кам лизосомавӣ номида буданд. Нигоҳдории рангкунандаро далели собитшуда ва ҷойи онро хулосаи муваққатӣ ҳисоб кунед. Хонандагоне, ки мехоҳанд пайгирӣ кунанд, ки электронҳо баъдан ба куҷо мераванд, метавонанд ба интиқоли электронии митохондриявӣ ва идораи равандҳои оксиду барқароршавӣ ва манзараи васеътари ҷаббиш ва тақсимшавӣ вобаста ба роҳи воридкунӣ гузаранд.

Ранггирӣ ченаки дучоршавӣ ба модда нест

Таҳқиқоти сеюм нишон медиҳад, ки вақте ин мантиқи воридшавӣ бо нишондиҳандаи биологӣ муқоиса мешавад, чӣ рӯй медиҳад. Скотт ва ҳамкоронаш муайян карданд, ки метил-бета-сиклодекстрин, сохтори қандии ҳалқашакл, мустақиман бо кабуди метиленӣ пайваст мешавад. Доимии ассотсиатсия барои комплекси фарогирӣ тақрибан 310 ба ҳар моляр буд, дар муқобили тақрибан 5846 ба ҳар моляр барои димершавии рангкунанда. Дар фибробластҳои L929 ин пайвастшавӣ ҳам ранггирии ҳуҷайра ва ҳам ангезиши ҷаббиши глюкозаро боздошт: пешинкубатсия бо сиклодекстрин ранггирии кабудро пешгирӣ кард ва илова кардани он баъдан рангзудоиро тезонд. Бо аз ҳуҷайраҳо нопадид шудани сигнали оптикии кабуд, интиқоли фаъолшудаи глюкоза низ ба таври зич ҳамзамон коҳиш ёфт.

Муаллифон ин ҳамбастагиро далеле ба фоидаи таъсири мутақобили мустақими рангкунанда бо сафеда дар роҳи фаъолсозии интиқолдиҳандаи глюкоза донистанд, на ба фоидаи механизми дарозмуддати фишори оксидшавӣ. Ин хулоса асоснок аст, аммо ҳудуд дорад. Озмоиш сафедаро муайян намекунад, пайвастшавӣ ба худи интиқолдиҳандаро нишон намедиҳад ва ҳамбастагии рангзудоӣ бо аз байн рафтани таъсир наметавонад ҳамаи роҳҳои миёнаравишавандаро тавассути оксиду барқароршавӣ истисно кунад.

Дарси пойдор ба ченкунӣ дахл дорад. Ранггирии оптикӣ рангкунандаи намоён, оксидшуда ва бо ҳуҷайра алоқамандро нишон медиҳад. Он захираи беранги барқароршударо тамоман намебинад, бинобар ин ҳуҷайраи камранг ҳам метавонад миқдори муайяни рангкунанда дошта бошад. Ҳуҷайраи шадидан ранггирифта бошад, аз рангкунандаи оксидшудаи дар дохил нигоҳдошташуда хабар медиҳад, на аз дучоршавии умумии бофта ба модда ё бузургии таъсир. Ҳамин огоҳӣ дар миқёси калонтар низ дуруст аст: муқоисаи ранггирии навъҳои гуногуни ҳуҷайраҳо ё далели дучоршавии бештар донистани буриши тираи бофта ҳамон хатои аввалини мушоҳидаи зарфро такрор мекунад. Воридшавӣ давраи барқароршавӣ, диффузия ва оксидшавии такрорӣ аст ва ҳар тасвири яклаҳзаинаи шакли кабуд танҳо як қисми онро нишон медиҳад. Паёмадҳои амалии ин барои рангкунии озмоишгоҳӣ ва кор бо модда ва барои тафсири иддаоҳо дар бораи воя ва дучоршавӣ ба модда бевосита аз ҳамин бармеоянд.