మిథిలీన్ బ్లూ ఈస్ట్ పరీక్షలు: సజీవ కణాలను లెక్కించడం, శ్వసన సమయాన్ని కొలవడం

పని బల్లపై రెండు ట్యూబులు ఉన్నాయి. రెండూ నీలంగా ఉన్నాయి. ఒకదానిలో, సూక్ష్మదర్శినిలో కనిపించే నీలి కణాలు చనిపోయిన ఈస్ట్‌ను సూచిస్తాయి. మరొకదానిలో, ట్యూబులోని ద్రావణం నీలం నుంచి రంగులేనిదిగా మారితే ఈస్ట్ సజీవంగా ఉండి శ్వసిస్తోందని అర్థం. ఒకే రంగు పదార్థం, కానీ వ్యతిరేక అర్థాలు. ఈ రెండు పరీక్షలను కలిపి అర్థం చేసుకుంటే ప్రతి నిర్ధారణ తలకిందులవుతుంది.

ఈ తేడానే ఈ వ్యాసానికి ప్రధానాంశం. మిథిలీన్ బ్లూ ఒక రెడాక్స్ రంగు పదార్థం: ఆక్సీకరణ చెందినప్పుడు నీలంగా ఉంటుంది; రిడక్షన్ చెందినప్పుడు రంగులేని ల్యూకోమిథిలీన్ బ్లూగా మారుతుంది. జీవ్యత గణన ఈ రసాయన ప్రక్రియను స్వల్పకాలిక సూక్ష్మదర్శిని పరిశీలనలో ఉపయోగిస్తుంది. శ్వసన ప్రయోగం అదే ప్రక్రియను మొత్తం నమూనాలో సమయాన్ని కొలిచే ప్రతిచర్యగా ఉపయోగిస్తుంది. ప్రతిదానికీ ప్రత్యేక విధానం, ప్రత్యేక నియంత్రణ నమూనాలు, ఫలితాలను విమర్శనాత్మకంగా పరిశీలించే ప్రత్యేక దృష్టి అవసరం.

జీవ్యత గణన: స్వల్పకాలం రంగు వేసి, వెంటనే పరిశీలించాలి

బ్రూవరీ తరహా విధానం అత్యంత ప్రమాణీకరించిన రూపం. 2% సోడియం సిట్రేట్‌లో 0.01% w/v మిథిలీన్ బ్లూను తయారుచేసి, ఈస్ట్ సస్పెన్షన్‌తో 1:1 నిష్పత్తిలో కలపండి. ముందుగా నిర్ణయించిన స్వల్ప వ్యవధి తర్వాత ఆ మిశ్రమాన్ని పరిశీలించండి. ప్రచురిత విధానాల్లో ఈ వ్యవధి మారుతూ ఉంటుంది: బ్రూయింగ్ సైన్స్ ఇన్‌స్టిట్యూట్ హ్యాండ్‌బుక్లో 1 నుంచి 2 నిమిషాలు, పరిశోధన విధానాల్లో సుమారు 5 నిమిషాలు; OIV వైన్ సూక్ష్మజీవశాస్త్ర పద్ధతి ప్రకారం 10 నిమిషాల్లోపు పరిశీలించాలి. గణన కోసం ఉపయోగించే మిశ్రమంలో రంగు పదార్థం గాఢత చివరకు సుమారు 0.005% అవుతుంది. మెరుగుపరచిన Neubauer చాంబర్‌లో నమూనాను నింపి, సుమారు 400x వద్ద ముదురు నీలి కణాలను జీవ్యత లేనివిగా, రంగు పట్టని కణాలను జీవ్యత ఉన్నవిగా వర్గీకరించండి. OIV పద్ధతిలో లేత నీలి కణాలను సజీవంగా లెక్కిస్తారు; ఇది కింద చర్చించే వ్యక్తిగత అంచనా ప్రభావాన్ని ముందుగానే సూచిస్తుంది.

కణాల సాంద్రత చాంబర్ జ్యామితి ఆధారంగా లెక్కించబడుతుంది. మధ్యలోని పూర్తి 1 mm చతురస్రాన్ని లెక్కించినప్పుడు, ప్రతి mLలో కణాల సంఖ్య N గుణింతం పలుచన గుణకం గుణింతం 10^4 అవుతుంది. ఇక్కడ N అనేది ఆ ప్రాంతంలో లెక్కించిన కణాల సంఖ్య; ఇది ASBC ఈస్ట్ పద్ధతుల్లో వివరించబడింది. జీవ్యత లెక్క మరింత సరళం: రంగు పట్టని కణాలను మొత్తం కణాలతో భాగించి, 100తో గుణించాలి. FEMS బ్రూవరీ తులనాత్మక అధ్యయనం, OIV ఆచరణను అనుసరించి, జీవ్యత అంచనా కోసం సుమారు 400 కణాలను లెక్కించండి. ఒకే సరిహద్దు నియమాన్ని స్థిరంగా పాటించండి. ఉదాహరణకు, దిగువ, ఎడమ గ్రిడ్ రేఖలపై ఉన్న కణాలను చేర్చి, ఎగువ, కుడి రేఖలపై ఉన్నవాటిని మినహాయించండి.

గణన ప్రారంభించే ముందే మొగ్గలను ఎలా లెక్కించాలో నిర్ణయించాలి. సాధారణంగా అనుసరించే నియమం ప్రకారం, మొగ్గ మాతృకణం పరిమాణంలో సుమారు సగానికి చేరినప్పుడు దాన్ని ప్రత్యేక కణంగా లెక్కిస్తారు; అంతకంటే చిన్నదైతే మాతృకణంతో కలిపి లెక్కిస్తారు. ఏ నియమాన్ని ఎంచుకున్నా, ప్రతి చతురస్రానికీ దాన్ని వర్తింపజేసి, వర్క్‌షీట్‌పై రాయండి. తద్వారా తర్వాతి వ్యక్తి కూడా అదే విధంగా లెక్కించగలరు.

గణన వర్క్‌షీట్ (దీన్ని ముద్రించండి)

ఈ వర్క్‌షీట్ ఈ వ్యాసం కోసం ప్రత్యేకంగా రూపొందించబడింది. దీన్ని నోట్‌బుక్‌లో కాపీ చేసుకోండి లేదా ప్రతి నమూనాకు ఒకటి చొప్పున ముద్రించండి.

Viability (%) = 100 x unstained / (unstained + dark blue). Total cells per mL = N x dilution factor x 10^4, ఇక్కడ N నిర్ణయించిన చాంబర్ ప్రాంతం నుంచి తీసుకున్న కణాల సంఖ్య. ఈ సూత్రాల్లో unstained అంటే రంగు పట్టని కణాలు, dark blue అంటే ముదురు నీలి కణాలు, dilution factor అంటే పలుచన గుణకం. ఫలితం పక్కనే రంగు పట్టించిన వ్యవధిని నమోదు చేయండి; సమయ వివరంలేని జీవ్యత విలువను అదే విధంగా పునరుత్పత్తి చేయలేము.

జీవ్యత విలువలు ఎందుకు మారుతాయి

సమయం మొదటి ఆటంకం; అది రెండు విధాలుగా ప్రభావం చూపుతుంది. జీవక్రియాపరంగా చురుకైన కణాలు రంగు పదార్థాన్ని రిడక్షన్ చేస్తాయి. అందువల్ల చాలా త్వరగా పరిశీలిస్తే, సజీవ కణాలు ఆ ప్రక్రియను పూర్తి చేయకముందే కనిపించి, వాటిని చనిపోయినవిగా తప్పుగా వర్గీకరించవచ్చు. అయితే ఎక్కువసేపు రంగు పదార్థానికి గురిచేయడం కూడా విషప్రభావాన్ని కలిగించి, నిజంగా దెబ్బతిన్న నీలి కణాలను సృష్టిస్తుంది; ఫలితంగా మృత కణాలుగా తప్పుగా గుర్తించే రంగు ఫలితం వస్తుంది. అందుకే ప్రయోగశాల బోధనా విధానం 5 నిమిషాల్లోపు కణాలను వర్గీకరించాలని నిర్దేశిస్తుంది; ఇది విస్కాన్సిన్ ఈస్ట్ బోధనా విధానంలో నమోదు చేయబడింది. జాగ్రత్తగా చెప్పాల్సిన విషయం ఏమిటంటే, మిథిలీన్ బ్లూ ఆధారిత వర్గీకరణ సమయంపై ఆధారపడుతుంది. కాబట్టి ఒక స్వల్ప వ్యవధిని నిర్ణయించి, ఒక శ్రేణిలోని ప్రతి నమూనాకూ అదే వ్యవధిని పాటించాలి.

తక్కువ జీవ్యత ఉన్న నమూనాల్లో రెండవ పాక్షికత ఉంటుంది. జీవ్యత సుమారు 80% కంటే తక్కువగా ఉన్నప్పుడు మిథిలీన్ బ్లూ నిజమైన జీవ్యతను ఎక్కువగా అంచనా వేయవచ్చని ప్రమాణీకరించిన పద్ధతి హెచ్చరిస్తుంది. ఎందుకంటే రంగు పదార్థాన్ని ఇంకా రిడక్షన్ చేయగల కణాలకు పునరుత్పత్తి సామర్థ్యం తప్పనిసరిగా ఉండకపోవచ్చు. జీవ్యత గణనీయంగా తగ్గినప్పుడు ఇదే విశ్వసనీయత లోపాన్ని బ్రూయింగ్ సాహిత్యం కూడా వివరిస్తుంది. మిథిలీన్ బ్లూను వేగవంతమైన, సుమారు అంచనాగా పరిగణించండి. తక్కువ జీవ్యతకు సంబంధించిన కీలక నిర్ణయాలను—ఉదాహరణకు, కల్చర్‌ను మళ్లీ కిణ్వప్రక్రియలో ఉపయోగించడం—ప్లేట్ గణనలు లేదా అనుబంధ రంగు పరీక్షతో నిర్ధారించండి.

నమూనా మాధ్యమ ప్రభావాలు మూడవ అంశం. OIV పద్ధతి సుమారు pH 4.6 వద్ద నిర్వహించబడుతుంది. తక్కువ pHతో బలమైన బఫరింగ్ సామర్థ్యం ఉన్న నమూనాలు రంగు పదార్థం సరిగ్గా ప్రవర్తించకుండా అడ్డుకుంటాయని అది హెచ్చరిస్తుంది. అలాగే 100 g/L కంటే ఎక్కువ చక్కెర ఉన్నప్పుడు ఈ పరీక్ష చేయవద్దని సూచిస్తుంది; అటువంటి పరిస్థితుల్లో కణాలు తప్పుదారి పట్టించే లేత నీలి రంగులో కనిపిస్తాయి. రంగు పట్టించే సమయంలో pH ప్రభావాన్ని ప్రయోగాత్మకంగా పోల్చిన అధ్యయనంలో, పరీక్షించిన పరిధిలో సున్నితత్వం గణనీయంగా మారింది. ఇది pHపై ఆధారపడే మిథిలీన్ బ్లూ పద్ధతి అధ్యయనానికి అనుగుణంగా ఉంది. అవశేషాలు మరో చిక్కు: మలినాలతో కూడిన మాష్‌లలో రంగు పట్టిన రేణువులు మృత కణాల్లా కనిపించి, వేర్వేరు పరిశీలకుల మధ్య ఫలితాల వ్యత్యాసాన్ని పెంచుతాయి.

ఈ వ్యత్యాసం కేవలం అనుభవాల ఆధారంగా చెప్పినది కాదు; దాన్ని కొలిచారు. FEMS ఈస్ట్ తులనాత్మక అధ్యయనంలో నివేదించిన ఆరు నెలల బ్రూవరీ పరిశీలనలో, రెండేసి సార్లు చేసిన మిథిలీన్ బ్లూ కొలతల ప్రామాణిక విచలనం సగటున 6.1% ఉండగా, ఆక్సోనాల్ ఫ్లో సైటోమెట్రీలో అది 0.2% ఉంది. ఒకే నమూనాపై ఇద్దరు పరిశీలకుల ఫలితాలు 13 శాతం పాయింట్ల వరకు భిన్నంగా ఉన్నాయి. జీవ్యత పద్ధతులపై 2023 పరిమాణాత్మక తులనలో ఫ్లోరెసెన్స్ సూక్ష్మదర్శిని పరీక్ష, ఫ్లో సైటోమెట్రీ గణనీయంగా అధిక ఖచ్చితత్వాన్ని చూపాయి. అయితే పనితీరు జీవజాతి, నమూనా మాధ్యమంపై ఆధారపడుతుందని కూడా అది చూపించింది. Painting మరియు Kirsop (PMID 24430080) అందించిన ప్రామాణిక పద్ధతి వివరణ ఇప్పటికీ ప్రధాన సూచనగా ఉంది. మరింత విస్తృతమైన ఈస్ట్ జీవ్యత, జీవక్రియా చురుకుదనం పరీక్షల సమీక్ష (PMID 25154541) మిథిలీన్ బ్లూను నిర్ణయాత్మక పరీక్షగా కాకుండా అనుబంధ పరీక్షల్లో ఒకటిగా ఉంచుతుంది. ఇక్కడ ట్రైపాన్ బ్లూ తప్పనిసరిగా మెరుగైన ప్రత్యామ్నాయం కాదు: అది కణ త్వచ సమగ్రత కోల్పోవడాన్ని సూచిస్తుంది; మిథిలీన్ బ్లూ మాత్రం కణం రంగు పదార్థాన్ని తీసుకోవడం, దాన్ని రిడక్షన్ చేసే చురుకుదనం రెండింటినీ సూచిస్తుంది. అందువల్ల ఒత్తిడికి గురైన కణాలు ఈ రెండు రంగు పదార్థాలతో వేర్వేరుగా వర్గీకరించబడవచ్చు.

శ్వసన ప్రయోగం: నీలి రంగు మాయమయ్యే సమయాన్ని కొలవండి

రెండవ పరీక్షలో సూక్ష్మదర్శిని ఉపయోగించరు. ఈస్ట్, గ్లూకోజ్, పలుచని మిథిలీన్ బ్లూ ద్రావణాన్ని మూసిన ట్యూబులో ఉంచి, నీలి రంగు పూర్తిగా పోవడానికి ఎంత సమయం పడుతుందో గడియారంతో కొలుస్తారు. కణాలు జీవక్రియను నిర్వహిస్తున్నప్పుడు, నీలి రంగు పదార్థాన్ని రంగులేని రూపంలోకి మార్చే రిడక్షన్ సమతుల్యాలను ఉత్పత్తి చేస్తాయి. అదే సమయంలో ద్రావణంలో కరిగి ఉన్న ఆక్సిజన్ దాన్ని తిరిగి ఆక్సీకరణ చేస్తుంది. కణాలు ఆక్సిజన్‌ను తగ్గించిన తర్వాత, నికర రిడక్షన్ ఆధిక్యం సాధించి, ట్యూబులోని ద్రావణం రంగును కోల్పోతుంది. అందువల్ల పరీక్ష ముగింపు స్థానం శ్వసనం, రంగు పదార్థం గాఢత, ఆక్సిజన్ లభ్యత మధ్య సమతుల్యతను ప్రతిబింబిస్తుంది. దాన్ని మిథిలీన్ బ్లూ రిడక్షన్ సమయం లేదా రంగు తొలగింపు సమయంగా నివేదించాలి; ప్రత్యక్ష పరమాణు ఆక్సిజన్ వినియోగ రేటుగా కాదు.

కొలిచే సమయం అనుకూలమైన పరిధిలో ఉండేలా, జీవ్యత పరీక్షలో కంటే చాలా పలుచని రంగు ద్రావణాన్ని ఉపయోగించండి. AQA A స్థాయి తప్పనిసరి ప్రాయోగిక హ్యాండ్‌బుక్ దీన్ని బాగా ప్రమాణీకరిస్తుంది: సుమారు 30 Cకు వేడిచేసిన ప్రతి 100 mL నీటికి 1 g గ్లూకోజ్, ఉపయోగించే ముందు వెంటనే కలిపే 5 g ఎండబెట్టిన ఈస్ట్, 1% స్టాక్ ద్రావణం నుంచి 0.1 mL తీసుకుని 100 mLకు పలుచన చేయడం ద్వారా తయారుచేసిన సుమారు 0.001% పని రంగు ద్రావణం. 2 mL ఈస్ట్–గ్లూకోజ్ సస్పెన్షన్‌ను 2 mL పని రంగు ద్రావణంతో కలిపి, పరీక్ష ఉష్ణోగ్రతకు చేరనివ్వండి. ఒకసారి 10 సెకన్లు కుదిపి, టైమర్ ప్రారంభించండి; మళ్లీ కుదపవద్దు. కుదపడం ఆక్సిజన్‌ను మళ్లీ ప్రవేశపెట్టి, ట్యూబులోని ద్రావణాన్ని తిరిగి నీలంగా మారుస్తుంది. విధానం వల్ల ఏర్పడే అతిపెద్ద కృత్రిమ ప్రభావం ఇదే. సాధారణంగా ఈ తయారీ 35 C వద్ద సుమారు 5 నిమిషాల్లో రంగును కోల్పోవాలని AQA పేర్కొంటుంది. ప్రయోగాల్లో సగటు సమయాలు 20 C వద్ద 275 s, 35 C వద్ద 128 s, 45 C వద్ద 145 s. ఇవి ఒక నిర్దిష్ట అమరికలోని ఉదాహరణలు మాత్రమే; సార్వత్రిక ప్రమాణాలు కావు. నియంత్రిత పరిస్థితుల్లో రిడక్షన్ రేటుకు, జీవక్రియాపరంగా చురుకైన ఈస్ట్‌కు మధ్య పరిమాణాత్మక సంబంధాన్ని ప్రత్యేక రిడక్షన్ అధ్యయనాలు సమర్థిస్తున్నాయి. వాటిలో PMID 25773544గా సూచీకరించిన పరిశోధన, Yeast (2014)లోని క్రియావిధాన అధ్యయనం ఉన్నాయి.

కాలక్రమ ప్రదర్శన (ప్రత్యేకంగా రూపొందించిన వనరు)

కింద పట్టిక ఈ వ్యాసం కోసం ప్రత్యేకంగా రూపొందించిన ప్రదర్శన. ఇందులో పైన వివరించిన AQA తరహా అమరికను ఉపయోగించారు: 2 mL ఈస్ట్–గ్లూకోజ్ మిశ్రమంతో సుమారు 0.001% గాఢత ఉన్న 2 mL పని రంగు ద్రావణాన్ని కలిపి, ఒకసారి 10 సెకన్లు కుదిపి, తర్వాత కదపకుండా ఇంక్యుబేషన్‌లో ఉంచడం. విద్యార్థుల బృందం నమోదు చేయాల్సిన రూపంలో ఈ ఉదాహరణ విలువలు ఇవ్వబడ్డాయి. రేటు సూచికను, సెకన్లలోని రంగు తొలగింపు సమయంతో 1ను భాగించిన విలువగా నిర్వచించారు. ఇదే ట్యూబులతో ప్రయోగం చేసి, ఈ నమోదుల స్థానంలో కొలిచిన విలువలను రాయండి.

A, B, C ట్యూబులకు ఉష్ణోగ్రతకు అనుగుణంగా రేటు సూచికను గ్రాఫ్‌లో చూపండి. వక్రరేఖ మొదట పెరిగి, తర్వాత సమతలమవుతుంది లేదా తగ్గుతుంది. ఇది ఎంజైమ్‌ల ఆధారంగా ఆశించే ధోరణి; సరళరేఖ కాదు. D, E, F ట్యూబులు ఆ వక్రరేఖపై డేటా బిందువులు కావు. ఆ వక్రరేఖను అర్థం చేసుకోవడానికి వీలు కల్పించే నియంత్రణ నమూనాలు అవి.

ప్రతి పరీక్షకు అర్థవంతమైన ఫలితాన్ని ఇచ్చే నియంత్రణలు

ప్రతి శ్వసన పరీక్షతో పాటు మూడు నియంత్రణ నమూనాలు అవసరం. మరిగించిన లేదా చంపిన ఈస్ట్, గ్లూకోజ్, రంగు పదార్థం కలిపిన నమూనా నీలంగానే ఉండాలి. వేగవంతమైన రిడక్షన్ సజీవ జీవక్రియపై ఆధారపడుతుందని ఇది నిరూపిస్తుంది. అదనంగా గ్లూకోజ్ కలపకుండా సజీవ ఈస్ట్, రంగు పదార్థం మాత్రమే ఉన్న నమూనా సబ్‌స్ట్రేట్ నియంత్రణగా పనిచేస్తుంది. అయితే ఈస్ట్ తన అంతర్గత నిల్వలను వినియోగిస్తుంది కాబట్టి, ఇందులో కూడా రంగు నెమ్మదిగా తొలగవచ్చని ఆశించాలి. ఈస్ట్ లేకుండా గ్లూకోజ్, రంగు పదార్థం మాత్రమే ఉన్న నమూనా రసాయన బ్లాంక్. ఇది తప్పనిసరి, ఎందుకంటే క్షార పరిస్థితుల్లో గ్లూకోజ్ ఏ కణాలూ లేకుండానే మిథిలీన్ బ్లూను రిడక్షన్ చేయగలదు.

జీవ్యత గణనకు వేరే రకమైన నియంత్రణ అవసరం: విధాన స్థిరత్వం. అదే రంగు పదార్థం స్టాక్ ద్రావణం, అదే మిశ్రమ నిష్పత్తి, అదే రంగు పట్టించే వ్యవధి, అదే చాంబర్ ప్రాంతం, అదే మొగ్గ, సరిహద్దు నియమాలను పాటించాలి. సాధ్యమైనప్పుడు నమూనా గుర్తింపు తెలియకుండా లెక్కించాలి. ఇద్దరు పరిశీలకుల ఫలితాలు పది పాయింట్ల మేర భిన్నంగా ఉన్నప్పుడు, సాధారణంగా వర్క్‌షీట్ కారణాన్ని వెల్లడిస్తుంది: వేర్వేరు సమయాలు, నీలి రంగును వర్గీకరించే వేర్వేరు పరిమితులు, లేదా వేర్వేరు మొగ్గ గణన నియమాలు. రంగు పట్టించిన కణాలను సిద్ధం చేయడం, పరిశీలించడం వంటి పద్ధతులు సరళమైన బ్యాక్టీరియా రంగు పట్టింపు పద్ధతులతో సంబంధం కలిగి ఉన్నాయి. వివిధ నమూనాల్లో ఈ రంగు పదార్థం ఏమేమి గుర్తిస్తుందనే విస్తృత వివరణ సూక్ష్మదర్శిని రంగు పట్టింపు అట్లాస్‌లో ఉంది. ఏ నీలి రంగు తీవ్రతనైనా పరిమాణాత్మకంగా అర్థం చేసుకోవడం వెనుక ఉన్న భౌతికశాస్త్రానికి సంబంధించి, పరిస్థితుల వివరాలతో కూడిన శోషణ సూచన ప్రతి గుణకంతో పాటు దాని ద్రావకం, pH, గాఢత పరిస్థితులను ఎందుకు పేర్కొనాలో వివరిస్తుంది.

ప్రశ్నను బట్టి పరీక్షను ఎంచుకోండి. ప్రస్తుతం ఎన్ని కణాలు సజీవంగా ఉన్నాయనేది గణనకు సంబంధించిన ప్రశ్న; సూక్ష్మదర్శిని, వర్క్‌షీట్‌తో దానికి సమాధానం లభిస్తుంది. ఈ కల్చర్ ఎంత చురుకుగా శ్వసిస్తోందనేది గతిశాస్త్రానికి సంబంధించిన ప్రశ్న; స్టాప్‌వాచ్, నియంత్రిత ట్యూబులతో దానికి సమాధానం లభిస్తుంది. మిథిలీన్ బ్లూ రెండింటికీ ఉపయోగపడుతుంది, కానీ ఒకే ట్యూబులో ఒకే సమయంలో రెండింటికీ కాదు.