మెథిలీన్ బ్లూ మరియు ఇన్‌ఫ్లమేటరీ సంకేత ప్రసారం: ఇన్‌ఫ్లమసోమ్‌లు, IL-6, మరియు STAT3

ఒకే నీలి సమ్మేళనం ఇన్‌ఫ్లమేషన్‌ను తగ్గిస్తుందని మూడు ప్రయోగశాలలు నివేదించాయని అనుకుందాం. ఒకటి మాక్రోఫేజ్‌ల నుంచి తక్కువ IL-1beta విడుదలవుతుందని చూపిస్తుంది. మరొకటి అదే రకం కణాల్లో iNOS ఎంజైమ్ తక్కువగా ఉందని చూపిస్తుంది. ఇంకొకటి రక్తంలో IL-6 తక్కువగా, మెదడులో STAT3 క్రియాశీలత తక్కువగా ఉన్నాయని చూపిస్తుంది. ఈ మూడింటినీ ఒకే వాదనగా కలిపేయాలనిపించవచ్చు. అలా కలపడం అసలు పరిశోధన ఫలితాన్ని మరుగుపరుస్తుంది.

ప్రతి ఫలితం వేర్వేరు సంకేత ప్రసార భావనకు సంబంధించినది. ప్రతిదానికీ దాని సొంత ప్రేరకం, నిర్మాణ దశ, కొలిచే సూచిక ఉంటాయి. మెథిలీన్ బ్లూ ఒక్కో భావనపై వేర్వేరు దశలో ప్రభావం చూపుతుంది. వీటిలో ఏదైనా ఆరోగ్య ఫలితాన్ని మెరుగుపరుస్తుందా అనేది వేరే ప్రశ్న; దాన్ని మా మెథిలీన్ బ్లూ మరియు ఇన్‌ఫ్లమేషన్‌పై సమగ్ర అవలోకనంలో చర్చించాం. ఈ పేజీ సంకేత మార్గాలకే పరిమితమవుతుంది.

మార్గం 1: ఇన్‌ఫ్లమసోమ్ నిర్మాణం మరియు caspase-1

ఇన్‌ఫ్లమసోమ్ అనేది అవసరమైనప్పుడు మైలోయిడ్ కణం లోపల ఏర్పడే ప్రోటీన్ ఆధార నిర్మాణం. దీని భాగాలు ఒక సెన్సర్, ASC అనే అడాప్టర్, caspase-1 అనే ఎఫెక్టర్ ఎంజైమ్. నిర్మాణం పూర్తయిన తర్వాత, caspase-1 అనేది pro-IL-1beta మరియు pro-IL-18లను వాటి స్రవించే రూపాలుగా విడదీస్తుంది. ఇది ఇన్‌ఫ్లమేటరీ కణ మరణ రూపమైన పైరోప్టోసిస్‌ను కూడా ప్రేరేపించగలదు. సెన్సర్ దాని రకాన్ని నిర్ణయిస్తుంది: NLRP3 స్ఫటికాలకు, నైజెరిసిన్ మరియు ATP వంటి రంధ్రాలు ఏర్పరిచే టాక్సిన్‌లకు ప్రతిస్పందిస్తుంది; NLRC4 బ్యాక్టీరియల్ ఫ్లాజెలిన్‌కు ప్రతిస్పందిస్తుంది; AIM2 సైటోసాల్‌లోని ద్వితంతు DNAకు ప్రతిస్పందిస్తుంది; నాన్-కానానికల్ మార్గం కణాంతర్గత లిపోపాలీసాకరైడ్‌కు ప్రతిస్పందిస్తుంది.

క్రియాశీలం కావడానికి రెండు సంకేతాలు అవసరం. మొదటి సంకేతం ప్రైమింగ్: టోల్-లైక్ రిసెప్టర్ లిగాండ్, NF-kB ఆధారిత NLRP3 మరియు pro-IL-1beta ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను ప్రేరేపిస్తుంది. దాంతో అవసరమైన భాగాలు అందుబాటులోకి వస్తాయి. రెండో సంకేతం నిర్మాణం: మరో ప్రేరకం వల్ల ASC ఒలిగోమరైజ్ అయి సూక్ష్మ గుంపులుగా ఏర్పడుతుంది, caspase-1 విడిపోయి దాని p20 భాగం ఏర్పడుతుంది, పరిపక్వ IL-1beta p17 విడుదలవుతుంది. మైటోకాండ్రియల్ రియాక్టివ్ ఆక్సిజన్ స్పీషీస్, స్ఫటికాల గ్రహణం NLRP3కు సంబంధించిన రెండో సంకేతానికి తోడ్పడతాయని తెలుసు.

విస్తృత ఇన్‌ఫ్లమసోమ్ నిరోధంపై 2017 మాక్రోఫేజ్ అధ్యయనం ఈ రెండు సంకేతాల వద్ద మెథిలీన్ బ్లూను పరీక్షించింది. లిపోపాలీసాకరైడ్‌తో ప్రైమ్ చేసిన ఎలుక ఎముక మజ్జ మాక్రోఫేజ్‌లలో, నైజెరిసిన్, ATP, మోనోసోడియం యూరేట్ స్ఫటికాలు ఒక్కొక్కటీ IL-1beta మరియు caspase-1 విడుదలతో పాటు ASC సూక్ష్మ గుంపుల ఏర్పాటును ప్రేరేపించాయి. 20 నుంచి 200 micromolar మెథిలీన్ బ్లూ, కణాలను చంపకుండా, మోతాదుపై ఆధారపడి ఈ మూడింటినీ తగ్గించింది. NLRC4 కోసం ఫ్లాజెలిన్ మరియు సాల్మొనెల్లా, AIM2 కోసం ద్వితంతు DNA మరియు లిస్టీరియా, నాన్-కానానికల్ మార్గం కోసం ట్రాన్స్‌ఫెక్ట్ చేసిన లిపోపాలీసాకరైడ్ లేదా సజీవ E. coli కూడా ఇదే నమూనాను చూపించాయి. సమ్మేళనం ఒక్కటే విడుదలను ప్రేరేపించలేదు. నియంత్రణ ప్లేట్‌లలో యాంటీబ్యాక్టీరియల్ ప్రభావం కనిపించలేదు. కాబట్టి ఈ ఫలితం ఆతిథేయి ప్రతిస్పందనకు సంబంధించినది.

ముందరి దశల్లో మూడు ప్రభావాలను కొలిచారు. రోటెనోన్ ప్రేరేపించిన మైటోకాండ్రియల్ సూపర్‌ఆక్సైడ్ మెథిలీన్ బ్లూతో తగ్గింది; దానితో పాటు రోటెనోన్ ప్రేరేపించిన IL-1beta విడుదల కూడా తగ్గింది. ఫ్లోరోసెంట్ పూసల గ్రహణం తగ్గింది. ఇది స్ఫటికాలను గుర్తించే ముందు ఫాగోసైటోసిస్ తగ్గిందనే విషయానికి అనుగుణంగా ఉంది. రెండు NF-kB స్థానాలు ఉన్న NLRP3 ప్రమోటర్ ఆధారంగా పనిచేసే రిపోర్టర్, మెథిలీన్ బ్లూతో తక్కువ క్రియాశీలతను చూపించింది. అయితే ఆ స్థానాలు లేని సంక్షిప్త ప్రమోటర్ ప్రతిస్పందించలేదు. కణాలు లేని పరీక్షా గొట్టంలో మెథిలీన్ బ్లూ, రీకాంబినెంట్ మానవ caspase-1 క్రియాశీలతను కూడా నేరుగా తగ్గించింది. సమ్మేళనాన్ని ప్రైమింగ్ సమయంలో మాత్రమే లేదా క్రియాశీలం చేసే సమయంలో మాత్రమే చేర్చినా IL-1beta, IL-18, caspase-1 విడుదల తగ్గింది. అంటే రెండు దశలూ ఇందులో భాగస్వాములే.

ఎలుకల్లోని పరీక్షలు కూడా ఈ ఎంపికాత్మకతను చూపించాయి. ప్రాణాంతక లిపోపాలీసాకరైడ్ మోతాదు నియంత్రణ గుంపులోని ఎలుకలను కొన్ని గంటల్లోనే చంపగా, మెథిలీన్ బ్లూ మనుగడను మెరుగుపరిచింది; పెరిటోనియల్ IL-1beta తగ్గింది కానీ అదే ద్రవంలో IL-6 తగ్గలేదు. లిస్టీరియా పెరిటోనైటిస్ నమూనాలో, మొత్తం కణాల సంఖ్య మారకుండా పెరిటోనియల్ IL-1beta తగ్గింది. నాలుగు ఇన్‌ఫ్లమసోమ్ రకాలలోనూ మానవ THP-1 మోనోసైట్‌లు ఎలుక మాక్రోఫేజ్‌ల మాదిరిగానే ప్రవర్తించాయి. ఇన్‌ఫ్లమసోమ్ ఫలితం IL-1beta మరియు IL-18 పరిపక్వతను వివరిస్తుంది, ప్రతి సైటోకైన్‌ను కాదు. అందుకే మైక్రోగ్లియా మరియు ఆస్ట్రోసైట్ ప్రయోగాల్లో మెదడు రోగనిరోధక కణాల ఆకారం, ఆధార నిర్మాణం ఏర్పడటానికి సంబంధించిన ప్రశ్నకు భిన్నమైన ప్రశ్నకు సమాధానమిస్తుంది.

మార్గం 2: NF-kB మరియు STAT1 బంధనం ద్వారా iNOS ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్

ఇండ్యూసిబుల్ నైట్రిక్ ఆక్సైడ్ సింథేజ్, లేదా iNOS, విశ్రాంతి స్థితిలో దాదాపుగా ఉండదు; అవసరమైనప్పుడు దాని ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ జరుగుతుంది. లిపోపాలీసాకరైడ్ ప్రధానంగా IkB-alpha విచ్ఛిన్నం, ఆ తర్వాత NF-kB ఫాస్ఫోరిలేషన్ మరియు కేంద్రక ప్రవేశం ద్వారా దీన్ని ప్రేరేపిస్తుంది. ఇంటర్‌ఫెరాన్-గామా ప్రధానంగా జానస్ కైనేజ్ ద్వారా STAT1 ఫాస్ఫోరిలేషన్, ఆ తర్వాత STAT1 కేంద్రక ప్రవేశం ద్వారా దీన్ని ప్రేరేపిస్తుంది. ఆ తర్వాత ప్రతి కారకం iNOS ప్రమోటర్‌పై తన స్థానానికి బంధిస్తుంది. ఎంజైమ్ క్రియాశీలత, జన్యు ప్రేరేపణ వేర్వేరు నియంత్రణ స్థానాలు. ఒక ఔషధం వీటిలో ఏదో ఒకదానిపై లేదా రెండింటిపైనా పనిచేయవచ్చు.

మాక్రోఫేజ్‌లు మరియు ఎండోటాక్సీమియా ఉన్న ఎలుకల్లో iNOS ప్రేరేపణపై 2015 అధ్యయనం ఈ ప్రభావాన్ని జన్యు సందేశ స్థాయిలో గుర్తించింది. RAW 264.7 కణాలు మరియు ప్రాథమిక ఎలుక మాక్రోఫేజ్‌లలో, లిపోపాలీసాకరైడ్, ఇంటర్‌ఫెరాన్-గామా లేదా రెండింటికీ 30 minutes ముందు ఇచ్చిన 1 micromolar మెథిలీన్ బ్లూ, 8 నుంచి 24 hours వ్యవధిలో iNOS ప్రోటీన్ మరియు mRNAను తగ్గించింది. కల్చర్ మాధ్యమంలో నైట్రైట్ తగ్గింది, కణ జీవన సామర్థ్యం తగ్గలేదు. 25 mg per kg లిపోపాలీసాకరైడ్ ఇచ్చిన ఎలుకల్లో, ఒక గంట ముందు ఇచ్చిన ఒక్క 5 mg per kg మోతాదు ఊపిరితిత్తులు, కాలేయం, గుండెలో iNOS ప్రోటీన్ మరియు mRNAను తగ్గించింది.

ఏవి మారలేదనేదే ఇక్కడ ప్రత్యేకమైన విషయం. IkB-alpha విచ్ఛిన్నం, NF-kB ఫాస్ఫోరిలేషన్, STAT1 ఫాస్ఫోరిలేషన్, ఈ రెండు కారకాల కేంద్రక సంచయం యథావిధిగా కొనసాగాయి. అంతరాయం ఒక దశ తర్వాత వచ్చింది: లిపోపాలీసాకరైడ్ తర్వాత NF-kB తన DNA భాగానికి తక్కువగా బంధించిందని, ఇంటర్‌ఫెరాన్-గామా తర్వాత STAT1 తక్కువగా బంధించిందని కేంద్రక సారాలు చూపించాయి. కణాల లోపల iNOS ప్రమోటర్ వద్ద ఈ రెండు కారకాల బంధన ఆక్యుపెన్సీ తగ్గిందని క్రోమాటిన్ ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ నిర్ధారించింది. ప్రమోటర్‌లో NF-kBను ఉపయోగించే ట్యూమర్ నెక్రోసిస్ ఫాక్టర్ ఆల్ఫా కూడా తగ్గింది. కారకాలు క్రియాశీలమై అక్కడికి చేరుకున్నాయి, కానీ తమ లక్ష్య DNAతో సరిగా బంధించలేదు.

మార్గం 1తో ఉన్న వ్యత్యాసాన్ని గమనించండి. ఇది కారకం DNAతో బంధించడానికి సంబంధించినది; STAT3 కాకుండా STAT1ను ఉపయోగిస్తుంది; ASC సూక్ష్మ గుంపులు, caspase-1 భాగాలకు బదులుగా mRNA, ప్రోటీన్, నైట్రైట్‌ను కొలుస్తుంది. మా కణ నమూనాల్లో మెథిలీన్ బ్లూ లక్ష్యాల పటం ఈ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ స్థాయిని ప్రత్యక్ష ఎంజైమ్, మైటోకాండ్రియల్ కొలతల నుంచి వేరుగా ఉంచుతుంది.

మార్గం 3: సీరమ్ IL-6 మరియు కణజాల STAT3 క్రియాశీలత

IL-6, gp130 రిసెప్టర్ కుటుంబం ద్వారా జానస్ కైనేజ్ నుంచి STAT3 వరకు సాగే సంకేత శ్రేణిలోకి సంకేతాలను పంపుతుంది. ఫాస్ఫోరిలేట్ అయిన STAT3 డైమర్‌గా ఏర్పడి, కేంద్రకంలోకి ప్రవేశించి, ఇన్‌ఫ్లమేటరీ కార్యక్రమాలను నడిపిస్తుంది. IL-6 స్వయంగా NF-kB లక్ష్యం కావడంతో, ఈ రెండూ ఒక ఫీడ్‌బ్యాక్ వలయాన్ని ఏర్పరుస్తాయి. దీన్నే తరచుగా IL-6 నుంచి STAT3 వరకు అక్షం అంటారు. ముందరి దశలో సీరమ్ IL-6, ఫాస్ఫోరిలేట్ అయిన STAT3కు మొత్తం STAT3తో ఉన్న నిష్పత్తి, తర్వాతి దశల్లో iNOS మరియు COX2 వంటి ఎఫెక్టర్ ఎంజైమ్‌లు సాధారణంగా కొలిచే సూచికలు.

లిపోపాలీసాకరైడ్ తర్వాత IL-6 మరియు STAT3పై 2023 ఎలుకల అధ్యయనం వివిధ శరీర విభాగాల్లో ఈ అక్షాన్ని కొలిచింది. మగ C57BL/6 ఎలుకలకు మూడు రోజుల పాటు ప్రతిరోజూ 1 mg per kg లిపోపాలీసాకరైడ్ ఇచ్చారు. ప్రతి మోతాదు తర్వాత 30 minutesకు 5 లేదా 10 mg per kg మెథిలీన్ బ్లూ ఇచ్చారు. మూడో రోజు, లిపోపాలీసాకరైడ్ మాత్రమే ఇచ్చిన గుంపుతో పోలిస్తే రెండు మెథిలీన్ బ్లూ గుంపుల్లోనూ సీరమ్ IL-6 తక్కువగా ఉంది. అయితే పరీక్షించిన ఇతర సైటోకైన్‌లలో చాలా వరకు చికిత్సతో మారలేదు. కార్టెక్స్, హిప్పోకాంపస్, చెవి చర్మంలో ఫాస్ఫోరిలేట్ అయిన STAT3కు మొత్తం STAT3తో ఉన్న నిష్పత్తులు తక్కువగా ఉన్నాయి. Iba-1 మైక్రోగ్లియల్ స్టెయినింగ్, iNOS మరియు COX2 కూడా తక్కువగా ఉన్నాయి; బరువు తగ్గుదల కొంతవరకు తగ్గింది.

ఇక్కడ రెండు జాగ్రత్తలు అవసరం. సీరమ్ IL-6 తగ్గడం, కణజాల STAT3 ఫాస్ఫోరిలేషన్ తగ్గడం ఈ అక్షంలో మార్పుకు అనుగుణంగా ఉన్నప్పటికీ, ప్రధాన ప్రభావ స్థానం ఏదో నిర్ధారించదు. ఎందుకంటే ముందరి దశలో సైటోకైన్ తగ్గడం, రిసెప్టర్ సంకేత ప్రసారం తగ్గడం లేదా ఫాస్ఫటేజ్ క్రియాశీలత మారడం—వీటిలో ఏదైనా అదే నిష్పత్తిని కలిగించవచ్చు. అలాగే, మూడు రోజుల తీవ్రమైన ప్రేరణ సమయంలో బరువు అనేది మొత్తం జంతువుకు సంబంధించిన కొలత; అది లక్షణాల లేదా వ్యాధి ఉపశమన స్కోరు కాదు. సంకేత ప్రసార ఫలితాన్ని చికిత్స వాదనగా మార్చకుండా, ఇది బ్లాట్‌కు మించిన సందర్భాన్ని అందిస్తుంది. మైటోకాండ్రియల్ రెడాక్స్ నిర్వహణకు సంబంధించిన వేరైన రసాయన ప్రక్రియలు ఈ సైటోకైన్ వివరణకు సమాంతరంగా సాగుతాయి; వాటిని దీనితో కలపకూడదు.

మార్గాల పోలిక: ప్రభావం చూపే స్థానాలు మరియు కొలిచే సూచికలు

ఈ పట్టిక మూడు చెల్లని అన్వయాలను అడ్డుకుంటుంది. ASC సూక్ష్మ గుంపులకు సంబంధించిన ఫలితం STAT3 ఫలితాన్ని నిరూపించదు. STAT1 నుంచి iNOS ప్రమోటర్‌కు సంబంధించిన ఫలితం STAT3 ఫలితాన్ని నిరూపించదు, ఈ రెండు ప్రోటీన్‌లూ STAT కుటుంబ సభ్యులైనప్పటికీ. సీరమ్ IL-6 ఫలితం ఇన్‌ఫ్లమసోమ్ నిర్మాణం తగ్గిందని నిరూపించదు: పెరిటోనియల్ ప్రయోగంలో IL-1beta తగ్గగా, IL-6 తగ్గలేదు. ప్రతి వరుసకు దాని సొంత ప్రేరకం, కొలిచే సూచిక అవసరం. అందుకే కణ, జంతు, క్లినికల్ మెథిలీన్ బ్లూ అధ్యయనాలను చదివేటప్పుడు ప్రతి వాదనను దానికి సంబంధించిన కొలత స్థాయితో సరిపోల్చడం అవసరం.

వీటిలో ఏదీ మనుషుల్లో మోతాదు, భద్రత లేదా ప్రయోజనాన్ని నిర్ధారించదు. లిపోపాలీసాకరైడ్ నమూనాలు ఒక యంత్రాంగాన్ని పరీక్షించడానికి ఉపయోగించే నియంత్రిత ప్రేరకాలు; అవి దీర్ఘకాలిక అనారోగ్యానికి ప్రతిరూపాలు కావు. ప్రేరకంతో పాటు మోతాదు ఇవ్వడం, ఇప్పటికే ఏర్పడిన వ్యాధిని వెనక్కి మళ్లించడాన్ని కాకుండా, ప్రేరేపిత మార్పును నివారించడాన్ని పరీక్షిస్తుంది. ఈ యంత్రాంగ వివరణను రోగుల ఫలితాల నుంచి వేరుగా ఉంచండి. ఏ ఆరోగ్య వాదననైనా దాని వెనుక ఉన్న రోగుల అధ్యయనం ఆధారంగా అంచనా వేయండి.