G6PD ప్రయోగశాల పరీక్షల్లో మిథిలీన్ బ్లూ: ఈ రంజకం నిజంగా ఏం చేస్తుంది

ఇంక్యుబేషన్ తర్వాత ఒక విద్యార్థి రెండు పరీక్ష నాళికలను గమనిస్తాడు. ఒకటి ఆశించిన రంగులోకి మారింది. మరొకటి మారలేదు. రెండో రోగిలో గ్లూకోజ్-6-ఫాస్ఫేట్ డీహైడ్రోజినేస్ లోపం ఉందని విద్యార్థి నిర్ధారణకు వస్తాడు. ఆ నిర్ధారణ సరైనదే కావచ్చు, కానీ ఆ ఆలోచనలో పరీక్ష పనిచేయడానికి ఆధారమైన భావనను విస్మరిస్తున్నాడు. నాళికలో ఏదీ ఎంజైమ్‌ను నేరుగా కొలవదు. మిథిలీన్ బ్లూను మధ్యవర్తిగా ఉపయోగించి, ఎంజైమ్ ఉత్పత్తి చేసే పదార్థాన్ని నాళికలో కొలుస్తారు.

ఈ పరోక్ష కొలత అర్థమైతే, పరీక్ష విధానం, నియంత్రణ నమూనాలు, తప్పుడు ఫలితాలకు కారణాల సుదీర్ఘ జాబితా — ఇవన్నీ యాదృచ్ఛికమైనవిగా అనిపించవు.

సంక్షిప్త సమాధానం

G6PD పరీక్షలో మిథిలీన్ బ్లూ ఒక రెడాక్స్ సూచిక. G6PD ఎంజైమ్ NADPHను ఉత్పత్తి చేస్తుంది. NADPHపై ఆధారపడే వ్యవస్థలు నీలి రంగు మిథిలీన్ బ్లూను క్షయకరణం ద్వారా దాని రంగులేని ల్యూకో రూపంలోకి మారుస్తాయి లేదా ఎలక్ట్రాన్‌లను చేరవేయడానికి దాన్ని ఉపయోగిస్తాయి. సాధారణ ఎంజైమ్ క్రియాశీలత ఉన్నప్పుడు క్షయకరణం సమర్థంగా జరుగుతుంది. క్రియాశీలత లోపించినప్పుడు క్షయకరణం నెమ్మదిగా లేదా అసంపూర్ణంగా జరుగుతుంది. పరీక్షలో కనిపించే సంకేతం అంతా ఇదే.

రెండు చారిత్రక పద్ధతుల్లో ఒకే రంజకాన్ని ఉపయోగిస్తారు, కానీ ఫలితాన్ని సూచించే తుది స్థితి భిన్నంగా ఉంటుంది. ఈ రెండింటిని వేరుగా గుర్తిస్తే చాలా వరకు అయోమయం తొలగిపోతుంది.

రెండు పరీక్షలు, ఒక రంజకం, వేర్వేరు తుది స్థితులు

మొదటిది ప్రత్యక్ష మిథిలీన్ బ్లూ క్షయకరణ పరీక్ష. దీన్ని Sass, సహచరులు వివరించారు; తర్వాత Gibbs మూల్యాంకనం చేశారు. ఇందులో రంజకమే తుది స్థితిని సూచిస్తుంది: ఆక్సీకరణ చెందిన నీలి మిథిలీన్ బ్లూ క్షయకరణం ద్వారా రంగులేని ల్యూకోమిథిలీన్ బ్లూగా మారుతుంది. ఆ మార్పు వేగం NADPHను ఉత్పత్తి చేసే సామర్థ్యాన్ని ప్రతిబింబిస్తుంది. ప్రాథమిక స్క్రీనింగ్ పరిశోధన పత్రం PubMedలో Sass తదితరుల (1966) పేరుతో సూచీకరించబడింది.

రెండోది Brewer మెథీమోగ్లోబిన్ క్షయకరణ పరీక్ష. మొదట సోడియం నైట్రైట్ హీమోగ్లోబిన్‌ను ఆక్సీకరణం చేసి గోధుమ రంగు మెథీమోగ్లోబిన్‌గా మారుస్తుంది. తర్వాత మిథిలీన్ బ్లూ ఎలక్ట్రాన్ బదిలీ మధ్యవర్తిగా పనిచేస్తుంది: క్షయకరణ చెందిన మిథిలీన్ బ్లూ, క్షయకరణ సమతుల్యాలను మెథీమోగ్లోబిన్‌కు అందించి, దాన్ని తిరిగి ఎర్రని హీమోగ్లోబిన్‌గా మారుస్తుంది. అందువల్ల కనిపించే తుది స్థితి గోధుమ రంగు లేదా ఎరుపు రంగు; నీలం లేదా రంగులేని స్థితి కాదు. అసలు పద్ధతి ప్రపంచ ఆరోగ్య సంస్థ బులెటిన్‌లో (Brewer తదితరులు, 1960) ప్రచురితమైంది.

Brewer పరీక్షను రంజకం రంగు తొలగింపు పరీక్షగా పేర్కొనడం రసాయనపరంగా ఖచ్చితమైనది కాదు. రంజకం చక్రీయంగా పనిచేస్తుంది; రంగు మారేది హీమోగ్లోబిన్. కింద ఉన్న రేఖాచిత్రం రెండు ప్రక్రియలను చూపిస్తుంది.

ఆధారమైన రసాయన చర్య

పెంటోస్ ఫాస్ఫేట్ మార్గంలోని మొదటి ఆక్సీకరణ దశను G6PD ఉత్ప్రేరేపిస్తుంది:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

పరిపక్వ ఎర్ర రక్తకణాలు NADPH కోసం ఈ మార్గంపై ఎక్కువగా ఆధారపడతాయి. ఈ విషయాన్ని Bloodలో Luzzatto, సహచరులు (2020) సమీక్షించారు. NADPH గ్లూటాథయోన్‌ను క్షయకరణ స్థితిలో ఉంచి, ఆక్సీకరణ నష్టం నుంచి కణాన్ని రక్షిస్తుంది. ఈ వ్యవస్థలో మిథిలీన్ బ్లూ ఎలక్ట్రాన్ స్వీకర్తగా ప్రవేశిస్తుంది. తగినంత G6PD ఉంటే తగినంత NADPH లభిస్తుంది; దానివల్ల సమర్థమైన క్షయకరణం జరుగుతుంది. G6PD తక్కువగా ఉంటే ఈ గొలుసు మొదటి కడియం దగ్గరే తెగిపోతుంది.

రంజకాన్ని ఇంజిన్‌గా కాకుండా ఇంధన సూచికగా భావించండి. అది NADPH సరఫరాను సూచిస్తుంది. ఆ సరఫరాను లేదా ఫలితాన్ని చదివే విధానాన్ని ప్రభావితం చేసే ఇతర అంశాలు, జన్యువులో ఎలాంటి మార్పు లేకపోయినా, సూచికను మార్చగలవు.

Brewer తరహా పరీక్ష విధానం

దశాబ్దాలుగా అభికర్మకాల తయారీ విధానాలు మారుతూ వచ్చాయి. అందువల్ల బోధన కోసం ఇచ్చే వివరణను క్లినికల్ పరీక్ష ప్రోటోకాల్‌గా పొరబడకూడదు. ప్రతి ప్రయోగశాల తన సొంతంగా ధ్రువీకరించిన ప్రామాణిక నిర్వహణ విధానాన్ని అనుసరిస్తుంది. ఈ జాగ్రత్తను దృష్టిలో ఉంచుకుంటే, సాంప్రదాయ నాళిక పరీక్ష అమరిక ఇలా ఉంటుంది. మూడు నాళికలు, 3 గంటల ఇంక్యుబేషన్‌తో కూడిన ఈ రూపాన్ని ఈ ప్రచురిత అమలులో నమోదు చేశారు:

1. రోగి నమూనా నాళిక: సంపూర్ణ రక్తంతో పాటు గ్లూకోజ్, సోడియం నైట్రైట్, మిథిలీన్ బ్లూ. నైట్రైట్ మెథీమోగ్లోబిన్‌ను ఏర్పరుస్తుంది, గ్లూకోజ్ ఎర్ర రక్తకణాల జీవక్రియకు ఇంధనాన్ని అందిస్తుంది, రంజకం NADPHపై ఆధారపడే ఎలక్ట్రాన్ రవాణా మధ్యవర్తిగా పనిచేస్తుంది.
2. ఆక్సీకరణ నియంత్రణ నమూనా: రక్తంతో పాటు నైట్రైట్, గ్లూకోజ్ ఉంటాయి, కానీ మిథిలీన్ బ్లూ ఉండదు. ఇది గోధుమ రంగు మెథీమోగ్లోబిన్ తుది స్థితిని, అంటే లోపం ఉన్నప్పుడు కనిపించే నమూనాను చూపిస్తుంది.
3. హీమోగ్లోబిన్ నియంత్రణ నమూనా: రక్తంతో పాటు నీరు. ఇది ఎర్రని హీమోగ్లోబిన్ తుది స్థితిని, అంటే సాధారణ నమూనాను చూపిస్తుంది.
4. అన్ని నాళికలను సుమారు 37 C వద్ద, సాధారణంగా 3 గంటలపాటు, మెల్లగా కలుపుతూ ఇంక్యుబేట్ చేయాలి.
5. ప్రతి నాళిక నుంచి కొద్దిపాటి భాగాన్ని స్వేదనజలంలో కలిపి పలుచన చేయాలి. దీనివల్ల కణాలు విచ్ఛిన్నమై, రంగులను పోల్చడం సులభమవుతుంది.
6. రోగి నమూనా నాళికను రెండు నియంత్రణ నమూనాలతో పోల్చాలి. రంగు తిరిగి ఎరుపు వైపు మారడం గణనీయమైన క్షయకరణ సామర్థ్యాన్ని సూచిస్తుంది. గోధుమ రంగు కొనసాగడం గణనీయమైన లోపాన్ని సూచిస్తుంది.

ఒక చారిత్రక తయారీ విధానంలో సుమారు 1 mL రక్తంతో పాటు, దాదాపు 180 mM సోడియం నైట్రైట్, 280 mM డెక్స్ట్రోస్, 0.4 mM మిథిలీన్ బ్లూ గాఢతలలో అభికర్మకాలను ఉపయోగించారు. ఈ సంఖ్యలను పరిశోధన సాహిత్యంలోని ఒక ఉదాహరణగా పరిగణించాలి, సార్వత్రిక ప్రమాణంగా కాదు.

ఫలితాన్ని అర్థం చేసుకోవడం

గుణాత్మక స్క్రీనింగ్ సాధారణ క్రియాశీలతలో సుమారు 30 నుంచి 40 శాతం పరిధి వద్ద ఉత్తమంగా తేడాను గుర్తిస్తుంది. ఈ విషయాన్ని G6PD గుర్తింపులో లోటుపాట్లపై ఈ Malaria Journal సమీక్షలో చర్చించారు. కాబట్టి సాధారణ స్క్రీనింగ్ ఫలితం అంటే, పరీక్ష తీవ్రమైన లోపాన్ని గుర్తించలేదని మాత్రమే అర్థం. క్రియాశీలత పూర్తిగా సాధారణంగా ఉందని అది ధ్రువీకరించదు.

స్క్రీనింగ్ ఎందుకు తప్పుదారి పట్టించవచ్చు

హీమోలిసిస్ తర్వాత రెటిక్యులోసైటోసిస్ వల్ల సాధారణంగా ఉన్నట్లు తప్పుడు ఫలితం రావడం ఒక ప్రసిద్ధ ఉదాహరణ. కొత్త ఎర్ర రక్తకణాలు, రెటిక్యులోసైట్లలో పాత కణాల కంటే ఎక్కువ G6PD ఉంటుంది. తీవ్రమైన హీమోలిసిస్ సందర్భంలో అత్యంత పాతవి, ఎక్కువ లోపం ఉన్నవి అయిన కణాలు అప్పటికే నశించి ఉండవచ్చు. మిగిలిన కొత్త కణాల సమూహం పరీక్షలో సాధారణ క్రియాశీలతను చూపవచ్చు. ఇదే జీవశాస్త్ర ప్రక్రియ రంజక స్క్రీనింగ్‌లనే కాకుండా పరిమాణాత్మక పరీక్షలనూ తప్పుదారి పట్టిస్తుంది.

ఇటీవల జరిగిన రక్త మార్పిడి లోపాన్ని మరుగుపరుస్తుంది, ఎందుకంటే దాత ఎర్ర రక్తకణాలు నమూనాకు తమ సొంత ఎంజైమ్‌ను అందిస్తాయి. రెటిక్యులోసైటోసిస్, శ్వేత రక్తకణాల జోక్యంతో పాటు, ఎంజైమ్ ఫలితాలు నమ్మదగనివిగా మారడానికి కారణాల్లో Mayo Clinic Laboratories రక్త మార్పిడిని కూడా పేర్కొంటుంది.

హెటెరోజైగస్ స్త్రీలు అత్యంత క్లిష్టమైన సందర్భం. యాదృచ్ఛిక X-క్రోమోజోమ్ నిష్క్రియత వల్ల సాధారణ ఎర్ర రక్తకణాలు, లోపం ఉన్న ఎర్ర రక్తకణాలు కలిసిన సమూహం ఏర్పడుతుంది. మొత్తం క్రియాశీలత తీవ్రమైన లోపం నుంచి సాధారణంగా కనిపించే స్థాయి వరకు ఎక్కడైనా ఉండవచ్చు. గుణాత్మక స్క్రీనింగ్‌లు తరచుగా మధ్యస్థ ఫీనోటైప్‌లను గుర్తించలేవు. G6PD పరీక్షలపై WHO పత్రం ఈ పరిమితిని వివరంగా చర్చిస్తుంది.

నమూనా సేకరించి గడిచిన సమయం, నిల్వ ఉష్ణోగ్రత, రంగు ఆధారంగా తుది స్థితిని నిర్ణయించడంలో వ్యక్తిగత అంచనా, హీమటోక్రిట్, అభికర్మకాల నాణ్యత — ఇవి ఈ జీవసంబంధ ప్రభావాలకు అదనంగా విశ్లేషణలో అనిశ్చితిని కలిగిస్తాయి.

స్క్రీనింగ్ అనేది నిర్ధారణ కాదు

లోపాన్ని సూచించే, మధ్యస్థంగా ఉన్న, లేదా క్లినికల్ పరిస్థితికి సరిపోని స్క్రీనింగ్ ఫలితం వచ్చినప్పుడు పరిమాణాత్మక G6PD ఎంజైమ్ పరీక్ష అవసరం. ఉష్ణోగ్రత నియంత్రిత పరిమాణాత్మక స్పెక్ట్రోఫోటోమెట్రీని WHO ప్రామాణిక సూచన పద్ధతిగా పరిగణిస్తుంది. ఆ పరీక్షలో, ఎర్ర రక్తకణాలను విచ్ఛిన్నం చేసి తయారుచేసిన హీమోలైసేట్‌కు గ్లూకోజ్-6-ఫాస్ఫేట్, NADP+ కలుపుతారు. ఏర్పడే NADPHను 340 nm వద్ద పెరుగుతున్న కాంతి శోషణ ద్వారా గమనిస్తారు. మార్పు వేగం ఎంజైమ్ క్రియాశీలతకు అనులోమానుపాతంలో ఉంటుంది. సాధారణంగా దీన్ని హీమోగ్లోబిన్ పరిమాణానికి అనుగుణంగా, గ్రాముకు యూనిట్లుగా వ్యక్తపరుస్తారు. ప్రస్తుత క్లినికల్ ప్రయోగశాల పద్ధతులను G6PD క్రియాశీలతకు సంబంధించిన Mayo పరీక్షల జాబితా నమోదులో సంగ్రహించారు.

ఫలితాలను అర్థం చేసుకోవడానికి ప్రయోగశాల ధ్రువీకరించిన సూచన పరిధిని ఉపయోగిస్తారు. దీనిని తరచుగా జనాభాలోని సాధారణ క్రియాశీలతతో పోల్చి నిర్వచిస్తారు. సాధారణంగా 30 శాతం పరిమితి సమీపంలో లోపాన్ని, దాని కంటే పై స్థాయిలో మధ్యస్థ క్రియాశీలతను చర్చిస్తారు. G6PD పరీక్షల కోసం WHO లక్ష్య ఉత్పత్తి ప్రొఫైళ్లు (2022) ఈ నిర్ధారణ చట్రాన్ని వివరిస్తాయి. ఇటీవలి హీమోలిసిస్ లేదా రక్త మార్పిడి వల్ల ఫీనోటైప్ నిర్ణయం నమ్మదగనిదిగా మారితే, ఎర్ర రక్తకణాల సమూహం తిరిగి సమతుల్య స్థితికి వచ్చిన తర్వాత పరీక్షను పునరావృతం చేయాలి. అణు స్థాయి పరీక్షలు అదనపు సమాచారాన్ని అందించవచ్చు, కానీ అవి ఎంజైమ్ కొలతకు ప్రత్యామ్నాయం కావు.

పాటించాల్సిన ఒక ముఖ్యమైన హద్దు

ఈ పరీక్షల్లో మిథిలీన్ బ్లూ ఒక శరీరం వెలుపల ఉపయోగించే ప్రయోగశాల అభికర్మకం. రోగికి మిథిలీన్ బ్లూ ఇవ్వడంలోని భద్రతకు సంబంధించిన చర్చ వేరు; దాన్ని మిథిలీన్ బ్లూ వాడకూడని పరిస్థితులపై మార్గదర్శకాల్లో వివరించారు. ఔషధం కూడా NADPHపై ఆధారపడే క్షయకరణంపై ఆధారపడుతుంది కాబట్టి జీవరసాయన పరంగా ఈ రెండింటికి సంబంధం ఉంది. అయితే పరీక్ష నాళికలోని రంజకం, రక్తప్రవాహంలోకి ఇచ్చే మోతాదు ఒకటి కావు. మరో సందర్భంలో ఈ రంజకం కణాలకు రంగు అద్దే పదార్థంగా ఎలా పనిచేస్తుందో తెలుసుకోవడానికి మిథిలీన్ బ్లూ రంగు అద్దే సూత్రాలను చూడండి. అది చెందిన రసాయన కుటుంబం గురించి తెలుసుకోవడానికి ప్రయోగశాలలో రెడాక్స్ రంజకాల అంశాన్ని చూడండి.

క్షయకరణ సామర్థ్యం సక్రమంగా ఉన్నట్లు కనిపిస్తుందా అని స్క్రీనింగ్ అడుగుతుంది. వాస్తవంగా ఎంత ఎంజైమ్ ఉందని నిర్ధారణ పరీక్ష అడుగుతుంది. రెండో ప్రశ్నకు సమాధానం చెప్పమని అడగనంతవరకు, రంజకం మొదటి ప్రశ్నకు బాగా ఉపయోగపడుతుంది.