DNA మరియు RNA రంజనానికి మిథిలీన్ బ్లూ: జెల్‌లు మరియు మెంబ్రేన్‌లలో అనువర్తనాలు

ఒక విద్యార్థి అగరోజ్ జెల్‌ను నడిపి, దానికి మిథిలీన్ బ్లూతో రంగు వేస్తాడు. స్పష్టమైన బ్యాండ్ కనిపిస్తుందని ఆశించిన చోట ఏమీ కనిపించదు. పక్క ప్రయోగస్థలంలో ఒక పోస్ట్‌డాక్ అదే నీలి రంగు సీసాను ఉపయోగించి నార్తర్న్ మెంబ్రేన్‌కు రంగు వేసి, మూడు నిమిషాల్లో స్పష్టమైన రైబోసోమల్ బ్యాండ్‌లను పొందుతాడు. జెల్ విఫలమైందని విద్యార్థి నిర్ధారించుకుంటాడు. కానీ జెల్ విఫలం కాలేదు. ఆ రెండు పనులు వేర్వేరు; ఒకే రంజకం వాటికి వేర్వేరు సున్నితత్వం, వేర్వేరు నేపథ్యం, తదుపరి చర్యలకు వేర్వేరు నియమాలతో సమాధానం ఇస్తుంది.

మిథిలీన్ బ్లూతో DNA రంజనం, మిథిలీన్ బ్లూతో RNA రంజనం ఒకే రసాయన స్వభావాన్ని పంచుకున్నా, వాటి ప్రయోజనాలు ఒకటి కావు. జెల్‌లో, రంధ్రాలున్న మాతృకలో ఎంత న్యూక్లియిక్ ఆమ్లం ఉందో రంజకం చూపిస్తుంది. మెంబ్రేన్‌పై, బదిలీ సరిగ్గా జరిగిందా, లేన్‌లలో సమానంగా నమూనా లోడ్ చేశారా అనేది చూపిస్తుంది. ఈ తేడా స్పష్టమైతే, విధానాలు, గుర్తింపు పరిమితులు, అనుకూలత పరిమితులు అర్థమవుతాయి.

సంక్షిప్త సమాధానం

మిథిలీన్ బ్లూ ఒక సమతల ధనావేశ రంజకం. ఫాస్ఫేట్ పట్ల స్థిరవిద్యుత్ ఆకర్షణ, బేస్ జతల మధ్య చొచ్చుకుపోవడం, చిన్న గాడితో అనుబంధం వంటి చర్యల కలయిక ద్వారా ఇది న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాలతో సమయోజనేతరంగా, తిరిగి విడిపోయేలా బంధిస్తుంది. ఆ బంధాన్ని తిరిగి తొలగించగలగడమే ముఖ్యమైన విషయం. బ్యాండ్‌లకు రంగు వేసి దృశ్యకాంతిలో చూడవచ్చు, చిత్రీకరించవచ్చు; తరువాత క్లోనింగ్, హైబ్రిడైజేషన్ లేదా మళ్లీ ప్రోబ్ చేయడం కోసం రంగును తొలగించవచ్చు లేదా శుద్ధి చేయవచ్చు.

ద్వితంతు DNA ఉన్న అగరోజ్ జెల్‌ను మిథిలీన్ బ్లూతో రంజనం చేయడానికి ప్రామాణిక వేగవంతమైన తయారీ విధానం: నీటిలో 0.02 percent w/v (mLకు 200 micrograms), సుమారు 15 minutes రంజనం, తరువాత సుమారు 15 minutes నీటితో రంగు తొలగింపు; తెల్ల కాంతి పెట్టెపై పరిశీలించడం. మెంబ్రేన్‌లకు, సాంప్రదాయ నార్తర్న్ బ్లాట్ తయారీ విధానంలో pH 5.2 సమీపంలోని సోడియం అసిటేట్‌లో 0.02 నుంచి 0.04 percent రంజకాన్ని ఉపయోగిస్తారు. బదిలీ, స్థిరీకరణ తరువాత కొన్ని నిమిషాలు రంజనం చేసి, నీటితో కడిగి, హైబ్రిడైజేషన్‌కు ముందు పూర్తిగా రంగు తొలగిస్తారు. సున్నితత్వం పరిమితమే: మంచి పరిస్థితుల్లో ప్రతి జెల్ బ్యాండ్‌కు పదుల నుంచి వందల nanograms అవసరం; జాగ్రత్తపూర్వక మార్గదర్శకాలు 0.5 నుంచి 1 microgramగా పేర్కొంటాయి. ఇది ఎథిడియం బ్రోమైడ్, SYBR రంజకాల కంటే అనేక పరిమాణ స్థాయిల మేర ఎక్కువ. మెంబ్రేన్‌లపై ఒక్క ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌కు ఉపయోగకరమైన నిర్దిష్ట గుర్తింపు పరిమితి లేదు; ఎందుకంటే ఈ రంజకం ప్రధానంగా సమృద్ధిగా ఉండే రైబోసోమల్ RNAను, లోడ్ చేసిన మొత్తం పదార్థాన్ని చూపిస్తుంది. ఈ రెండు తయారీ విధానాల్లోనూ చిల్లరగా అమ్మే సప్లిమెంట్ ద్రావణాన్ని ప్రత్యామ్నాయంగా ఉపయోగించవద్దు. ధృవీకరించిన పద్ధతులు విశ్లేషణ-స్థాయి రంజకం, నిర్దిష్ట బఫర్‌లు, RNA ఉన్న సందర్భాల్లో RNase రహిత నిర్వహణను ఆధారంగా చేసుకుంటాయి.

బంధం ఎలా ఏర్పడుతుంది, ఎక్కడ తప్పుదోవ పట్టిస్తుంది

ఉపయోగకరమైన నమూనాలో మూడు భాగాలు ఉన్నాయి. మొదటిది, ధనావేశం కలిగిన వలయ నిర్మాణం ఋణావేశ ఫాస్ఫేట్ వెన్నెముకకు ఆకర్షితమవుతుంది. తక్కువ లవణ స్థాయిల వద్ద ఈ స్థిరవిద్యుత్ అంశమే ప్రధానమని స్పెక్ట్రోస్కోపిక్ పరిశోధనలు చూపిస్తున్నాయి. అదే సమయంలో, నమూనా అధ్యయనాలు, అణు గతిశాస్త్రం ద్వితంతు DNAకు బేస్ జతల మధ్య చొచ్చుకుపోవడాన్ని, చిన్న గాడితో బంధాన్ని స్థిరమైన విధాలుగా గుర్తిస్తున్నాయి; దీనిని మిథిలీన్ బ్లూ–DNA బంధంపై స్పెక్ట్రోస్కోపిక్ అధ్యయనం సంక్షిప్తంగా వివరిస్తుంది. రెండోది, కొంత GC ప్రాధాన్యత ఉంది. నమూనా అధ్యయనాలు CpG, GpC దశలకు మొగ్గు చూపగా, మిథిలీన్ బ్లూ చొచ్చుకుపోయే ప్రాధాన్యతలపై పరిశోధనలో ప్రయోగాలు GC అధికంగా ఉన్న ద్వితంతు నిర్మాణాలతో ఎక్కువ అనుబంధాన్ని నివేదించాయి. అయితే AT ద్వితంతు నిర్మాణాలు కూడా బంధిస్తాయి. సాధారణ రంజనం నిర్దిష్ట అనుక్రమాన్ని లక్ష్యంగా చేసుకోదు. మూడోది, ఏకతంతు DNA, RNA ప్రధానంగా స్థిరవిద్యుత్ చర్యలు, అందుబాటులో ఉన్న బేస్‌లు, ద్వితంతు ప్రాంతాలతో పొరలుగా అమరడం ద్వారా బంధిస్తాయి. అందుకే రంజన తీవ్రత పొడవు, అనుక్రమం, ద్వితీయ నిర్మాణాన్ని బట్టి మారుతుంది.

దీనివల్ల రెండు పరిణామాలు వస్తాయి. బంధం సమయోజనేతరమైనది కాబట్టి, కడిగినప్పుడు రంజకం తొలగిపోతుంది. ఉద్దేశపూర్వకంగా స్థిరీకరించకపోతే పాలీఅక్రిలమైడ్ బ్యాండ్‌లు త్వరగా వెలిసిపోతాయి. సాధారణ రంజనం తాత్కాలికమైనదే కాబట్టి ప్రత్యేక శాశ్వత స్థిరీకరణ విధానం ఉంది; దీనిని PAGE జెల్‌ల కోసం Soto మరియు Draper వివరించారు. ఈ రంజకం కాంతి-సంవేదకం కాబట్టి, ఆక్సిజన్ సమక్షంలో రంజనం చేసిన DNAపై ఎక్కువసేపు ప్రకాశవంతమైన కాంతి పడితే గ్వానిన్ ఆక్సీకరణ చెందవచ్చు, చివరకు తంతువుల్లో చిన్న కోతలు ఏర్పడవచ్చు. ఈ యంత్రాంగాన్ని మిథిలీన్ బ్లూ ద్వారా ప్రేరేపిత గ్వానిన్ ఆక్సీకరణపై పరిశోధన వివరిస్తుంది. కొద్దిసేపు తెల్ల కాంతిలో పరిశీలించడం వల్ల సాంప్రదాయ ఎథిడియం బ్రోమైడ్ విధానాల్లో బాగా తెలిసిన UV నష్టం తప్పుతుంది; తదుపరి ఉపయోగం కోసం DNAను వెలికితీయడంలో ఇది నిజమైన ప్రయోజనం. దృశ్యకాంతి తక్కువ హాని కలిగిస్తుంది, కానీ పూర్తిగా హానిరహితం కాదు. DNAను క్లోన్ చేయబోతే కాంతి పడే సమయాన్ని తగ్గించండి. ఈ జాగ్రత్త వెనుక ఉన్న విస్తృత కాంతిరసాయన శాస్త్రం కోసం మిథిలీన్ బ్లూ కాంతిరసాయన శాస్త్రంలోని రెండు మార్గాలు చూడండి. ఆక్సీకరణ చెందిన రూపం ఎందుకు బంధిస్తుందో, క్షయీకరణ చెందిన రూపం ఎందుకు బంధించదో వివరించే రెడాక్స్ జంట, ఆవేశ స్థితుల కోసం మిథిలీన్ బ్లూ నిర్మాణం మరియు లక్షణాల రసాయన శాస్త్రం చూడండి.

మొదటి పని: జెల్‌లలో రంజనం

జెల్ రంజనం ఒక ప్రశ్నకు సమాధానం ఇస్తుంది: ఈ బ్యాండ్‌లో కంటితో చూడగలిగేంత న్యూక్లియిక్ ఆమ్లం ఉందా? అగరోజ్‌లోని ద్వితంతు DNA అత్యంత బాగా అధ్యయనం చేసిన సందర్భం. Flores మరియు సహచరుల అసలు మిథిలీన్ బ్లూ జెల్ పద్ధతి 1 percent అగరోజ్‌పై 0.02 percent వేగవంతమైన విధానాన్ని ధృవీకరించి, ఆ తరువాత విజయవంతంగా DNAను వెలికితీయడం, క్లోనింగ్ చేయడం సాధ్యమని చూపించింది. ఇదే సరఫరాదారు విధానం IBI Scientific మిథిలీన్ బ్లూ ఉత్పత్తి పేజీలో కనిపిస్తుంది. అక్కడ 0.04 percent మెంబ్రేన్ తయారీ విధానం, వేగవంతమైన జెల్ విధానం పక్కపక్కనే ఇవ్వబడ్డాయి.

ఆచరణాత్మక విధానం:

1. జెల్‌ను సాధారణంగా నడపండి. సవరించిన పద్ధతిలో బదిలీ లేదా విభజన సామర్థ్యాన్ని ధృవీకరించకపోతే, ఎలెక్ట్రోఫోరెసిస్ సమయంలో కాకుండా అది పూర్తయిన తరువాత రంజనం చేయండి.
2. స్వేదనజలంలోని 0.02 percent w/v మిథిలీన్ బ్లూలో ముంచి, మెల్లగా కదిలిస్తూ సుమారు 15 minutes ఉంచండి.
3. నీటిని పలుమార్లు మార్చుతూ, మొత్తం సుమారు 15 minutes రంగును తొలగించండి; మాతృక నేపథ్య రంగు తగ్గి, బ్యాండ్‌లు స్పష్టంగా కనిపించే వరకు కొనసాగించండి.
4. తెల్ల కాంతి ప్రకాశకంపై వెంటనే ఫోటో తీయండి.

అగరోజ్, పాలీఅక్రిలమైడ్ వేర్వేరుగా ప్రవర్తిస్తాయి. అగరోజ్ మాతృకలో రంజకాన్ని నిలిపి ఉంచుతుంది కాబట్టి, రంగు తొలగింపే నెమ్మదిగా జరిగే దశ. పలుచని పాలీఅక్రిలమైడ్ జెల్‌లు త్వరగా రంగు పులుముకుంటాయి, కానీ అంతే త్వరగా రంగు కోల్పోతాయి. ఇది తదుపరి ఉపయోగం కోసం బ్యాండ్‌లను కత్తిరించి తీసుకోవడానికి సహాయపడుతుంది; దీర్ఘకాలిక రికార్డులకు మాత్రం ప్రతికూలం. స్థిరపడిన Current Protocols తరహా PAGE పద్ధతులను అనుసరిస్తూ, పాలీఅక్రిలమైడ్‌లోని సంశ్లేషిత ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌లను అదే 0.02 percent తయారీ విధానంతో, పదేపదే నీటితో కడుగుతూ 20 నుంచి 30 minutesలో గుర్తించవచ్చు. తదుపరి ఉపయోగం కోసం ఒలిగోలను సిద్ధం చేయడంలో పలుచని TBEలో సుమారు 0.0002 percent వంటి అత్యంత పలుచని విధానాలను కొన్ని గంటలపాటు ఉపయోగించినట్లు నివేదికలు ఉన్నాయి; అయితే వాటికి ఆధారాలు తక్కువ.

DNA, RNA మధ్య తేడా ముఖ్యం. ద్వితంతు DNA అత్యంత బలమైన నిర్మాణాత్మక బంధాన్ని ఇస్తుంది. RNA, ఏకతంతు DNA కూడా రంగు పులుముకుంటాయి, కానీ బలహీనంగా, తక్కువ అంచనా వేయగలిగేలా ఉంటాయి. ఫార్మాల్డిహైడ్ అగరోజ్ RNA జెల్‌ల విషయంలో, చాలా ప్రయోగశాలలు జెల్‌లో నీలి రంజనం చేయకుండా ముందుగా RNAను మెంబ్రేన్‌కు బదిలీ చేసి, అక్కడ రంజనం చేస్తాయి. ఈ మార్పుతో బలహీనమైన జెల్ సంకేతానికి బదులుగా స్పష్టమైన మెంబ్రేన్ సంకేతం, లోడింగ్ రికార్డు లభిస్తాయి.

రెండో పని: మెంబ్రేన్‌లపై రంజనం

మెంబ్రేన్ రంజనం వేరే ప్రశ్నకు సమాధానం ఇస్తుంది: బదిలీ సరిగ్గా జరిగిందా, లేన్‌లను పోల్చవచ్చా? సాంప్రదాయ అనువర్తనం Herrin మరియు Schmidt రూపొందించిన, తిరిగి తొలగించగల నార్తర్న్ బ్లాట్ రంజనం. అసలు విధానంలో pH 5.0 వద్ద 50 mM సోడియం అసిటేట్‌లో 0.04 percent రంజకాన్ని 2 నుంచి 3 minutes ఉపయోగించి, నీటితో కడిగేవారు. హైబ్రిడైజేషన్‌కు ముందు SSPEలోని పలుచని SDSతో ఈ రంగును తొలగించవచ్చు.

విస్తృతంగా ఉపయోగించే ఆధునిక విధానం ఇలా ఉంటుంది:

1. RNA లేదా వికృతీకరించిన DNAను నైలాన్ లేదా నైట్రోసెల్యులోజ్‌కు బదిలీ చేయండి. తరువాత రంజనం సమయంలో నమూనా పోకుండా UV క్రాస్‌లింకింగ్ లేదా వేడి చేయడం ద్వారా స్థిరీకరించండి.
2. ఐచ్ఛికమైనా సాధారణంగా చేసే దశ: మెంబ్రేన్‌ను 5 percent అసిటిక్ ఆమ్లంలో సుమారు 15 minutes తడపండి.
3. pH 5.2 సమీపంలోని 0.3 నుంచి 0.5 M సోడియం అసిటేట్‌లో 0.02 నుంచి 0.04 percent మిథిలీన్ బ్లూతో 5 నుంచి 10 minutes రంజనం చేయండి.
4. నీటితో కడిగి 5 నుంచి 15 minutes రంగును తొలగించండి, చిత్రాన్ని నమోదు చేయండి; తరువాత హైబ్రిడైజేషన్‌కు ముందు మిగిలిన రంజకాన్ని తొలగించండి.

నార్తర్న్ పనుల్లో ధనావేశ నైలాన్ ప్రధానంగా ఉపయోగిస్తారు. అదే అసిటిక్ ఆమ్లం, అసిటేట్ విధానంతో నైట్రోసెల్యులోజ్ కూడా పనిచేస్తుంది. బదిలీని నిర్ధారించడానికి, 28S మరియు 18S బ్యాండ్‌లను పోల్చడానికి (లేదా బ్యాక్టీరియా RNAకు 23S మరియు 16S), ల్యాడర్‌లు, ప్రమాణ నమూనాలను గుర్తించడానికి, మొత్తం RNA సాధారణీకరణకు సుమారు రికార్డు ఉంచడానికి ఈ చిత్రాన్ని ఉపయోగిస్తారు. ప్రచురిత నార్తర్న్ పద్ధతులు లోడింగ్ తనిఖీల కోసం రంజనం చేసిన రైబోసోమల్ బ్యాండ్‌ల పరిమాణాన్ని కొలుస్తాయి. ఇందులో సాధారణీకరణ కోసం మిథిలీన్ బ్లూ రైబోసోమల్ బ్యాండ్‌లను ఉపయోగించిన పాడి విజ్ఞాన పరిశోధన కూడా ఉంది. సదరన్ మెంబ్రేన్‌లను కూడా ఇదే విధంగా చూడవచ్చు. అయితే నార్తర్న్ లోడింగ్, బదిలీ తనిఖీ కోసం ఈ రంజకం మరింత స్థిరపడింది. సదరన్ DNAను బదిలీకి ముందే వికృతీకరిస్తారు కాబట్టి, జెల్ సున్నితత్వ సంఖ్యలు అక్కడ వర్తించవు.

గుర్తింపు పరిమితులు, నేపథ్యం: నీలి రంజకం ఎక్కడ వెనుకబడుతుంది

దిగువ పోలిక ఉద్దేశపూర్వకంగానే సుమారుగా ఇవ్వబడింది. రంజకం పనితీరు జెల్ శాతం, బ్యాండ్ వెడల్పు, కాంతి వ్యవస్థ, రంగు తొలగింపులో పాటించే క్రమశిక్షణపై ఆధారపడి ఉంటుంది. ప్రతి సంఖ్యను ఖచ్చితమైన నిర్దేశంగా కాకుండా, పరిమాణ స్థాయికి సూచనగా పరిగణించండి.

ఈ పరిమిత సంకేతం ఉపయోగపడుతుందా లేదా అనేది నేపథ్య నియంత్రణ నిర్ణయిస్తుంది. స్వేచ్ఛా రంజకం తీవ్రమైన రంగు కలిగి ఉంటుంది. అందువల్ల బంధించిన రంజకాన్ని తొలగించకుండా, బంధించని రంజకాన్ని తొలగించడం ద్వారా వ్యత్యాసం వస్తుంది. ఎక్కువ గాఢత గల రంజకం అరుదుగా సున్నితత్వాన్ని పెంచుతుంది. ప్రధానంగా రంగు తొలగింపుకు పట్టే సమయాన్ని పెంచుతుంది. ఉపయోగించబోయే అదే జెల్, మెంబ్రేన్, కెమెరాతో పలుచనల శ్రేణిని పరీక్షించండి. సమగ్ర సాంద్రత ఇన్‌పుట్ పరిమాణానికి అనుపాతంగా ఉండే పరిధిని మాత్రమే ఉపయోగించండి. మిథిలీన్ బ్లూ అర్ధ-పరిమాణాత్మక లోడింగ్ సాధారణీకరణకు తోడ్పడుతుంది. ఇది విస్తృత డైనమిక్ పరిధి గల పరిమాణాత్మక పరీక్ష కాదు; ఎందుకంటే మెంబ్రేన్ సామర్థ్యం, బదిలీ సామర్థ్యం, సంతృప్త స్థితి, రంగు తొలగింపు లేన్ నుంచి లేన్‌కు మారుతాయి.

అనుకూలత పరిమితులు: రంజనం తరువాత ఏవి కొనసాగించవచ్చు

నీలి రంజనం తరువాత క్లోనింగ్ సాధ్యమని నిరూపించబడింది. Flores మరియు సహచరులు రంజనం చేసిన అగరోజ్ బ్యాండ్‌లను కత్తిరించి, DNAను వెలికితీసి, దాన్ని లిగేట్ చేసి కణాల్లోకి ప్రవేశపెట్టారు. UVతో ఎథిడియం బ్రోమైడ్ ఉపయోగించిన తరువాత కంటే మెరుగైన క్లోనింగ్ జరిగిందని నివేదించారు. దీనికి కారణం బహుశా తక్కువ కాంతి నష్టం; రంజకం స్వయంగా ఇచ్చే ప్రయోజనం కాదు. తెల్ల కాంతికి గురిచేసే సమయాన్ని తక్కువగా ఉంచి, వెలికితీసిన DNAను సాధారణ జెల్ ఎక్స్‌ట్రాక్షన్ శుద్ధి ప్రక్రియకు లోనుచేయండి.

PCR, సీక్వెన్సింగ్‌కు సంబంధించిన ఆధారాలు తక్కువ. మిగిలిన రంజకం న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాలతో బంధిస్తుంది కాబట్టి, ఎంజైమ్ దశలకు ముందు రంగు తొలగించి శుద్ధి చేయండి. నీలి జెల్ నుంచి సరిగ్గా శుద్ధి చేసిన DNA పనిచేస్తుందని ఆశించవచ్చు. కానీ నేరుగా చేరే రంజక అవశేషాలను వివిధ పాలిమరేస్‌లు, సీక్వెన్సింగ్ రసాయన విధానాలు ఎంతవరకు తట్టుకుంటాయో బాగా కొలవలేదు. అవి తట్టుకుంటాయని ఊహించవద్దు.

దశల క్రమాన్ని కచ్చితంగా పాటించినప్పుడు బ్లాట్ హైబ్రిడైజేషన్ అనుకూలంగా ఉంటుంది: బదిలీ, స్థిరీకరణ, రంజనం, నమోదు, రంగు తొలగింపు, హైబ్రిడైజేషన్. ఇదే Herrin మరియు Schmidt రూపొందించిన క్రమం. బదిలీకి ముందు రంజనం చేయడం లేదా రంగు తొలగింపును దాటవేయడం వేరే పద్ధతి; దానికి ప్రత్యేక ధృవీకరణ అవసరం. రంజకాన్ని తొలగించిన తరువాత, ప్రామాణిక ప్రోబ్ తొలగింపు, మళ్లీ ప్రోబ్ చేయడం సాధారణంగా కొనసాగుతాయి. అదే రంజక కుటుంబంతో కణ స్థాయి రంజనం గురించి, స్థిరీకరించిన పొర విధానంలోని తర్కం సజీవ కణ పద్ధతులకు ఎందుకు వర్తించదో తెలుసుకోవడానికి సూక్ష్మదర్శిని రంజన అట్లాస్ చూడండి.

శాశ్వత స్థిరీకరణ విధానాన్ని ఉపయోగించకపోతే, తదుపరి ఉపయోగం కోసం అగరోజ్ బ్యాండ్‌లను, నీలి రంజకంతో గుర్తించిన PAGE ఒలిగోలను కత్తిరించి తీసుకోవచ్చు. తిరిగి విడిపోయే బంధకానికి రంగు తొలగింపు తరువాత ఎలెక్ట్రోఎల్యూషన్ రసాయనపరంగా సాధ్యమే. అయితే మిథిలీన్ బ్లూకు నిర్దిష్టమైన నియంత్రిత దిగుబడి డేటా తక్కువగా ఉంది. ఎల్యూషన్ తరువాత లవణాలను తొలగించండి లేదా అవక్షేపింపజేయండి.

తరచూ ఎదురయ్యే వైఫల్యాలు

మసకగా కనిపించే జెల్ బ్యాండ్‌లు సాధారణంగా వర్ణమితీయ రంజకానికి సరిపడా ద్రవ్యరాశి లేదని సూచిస్తాయి; ముఖ్యంగా చిన్న ఏకతంతు లేదా RNA లక్ష్యాల విషయంలో. ఎక్కువ నమూనాను లోడ్ చేయండి, తాజా రంజకాన్ని ఉపయోగించండి, గాఢత పెంచే ముందు రంజన సమయాన్ని పొడిగించండి, రంగు తొలగింపును ముందుగానే ఆపండి. వ్యత్యాసం లేకుండా మొత్తం జెల్ నీలంగా ఉంటే, సాధారణంగా అతిగా రంజనం చేశారని లేదా నీటిని తగినన్ని సార్లు మార్చలేదని అర్థం. PAGE బ్యాండ్‌లు వెలిసిపోవడం సహజ రసాయన ప్రవర్తన; రంజనం విఫలమైందని కాదు. త్వరగా ఫోటో తీయండి. అసమానమైన మెంబ్రేన్ నేపథ్యం మడతలు, బుడగలు, వేలిముద్రలు, అసమాన కదలిక లేదా చోటుచోటు మాత్రమే జరిగిన బదిలీని సూచిస్తుంది. హైబ్రిడైజేషన్ నియంత్రణ లేకుండా దాన్ని అసమాన లోడింగ్‌గా భావించవద్దు. చెదిరిన, బలహీనమైన రైబోసోమల్ నమూనా క్షీణతను సూచించవచ్చు; కానీ అసంపూర్ణ బదిలీ, చాలా తక్కువ మొత్తం RNA (సాధారణ లేన్‌లలో కొన్ని నుంచి పదుల micrograms ఉంటాయి), లేదా అధికంగా రంగు తొలగించడం వల్ల కూడా రావచ్చు. రంజకం సమృద్ధిగా ఉండే రైబోసోమల్ RNAను చూపిస్తుంది. ఇది నిర్దిష్ట ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌ను చూపించదు. ఆ పని ప్రోబ్‌ది.

అతిశయోక్తులు లేకుండా భద్రత, నిర్వహణ

ఎథిడియం బ్రోమైడ్ కంటే మిథిలీన్ బ్లూను నిర్వహించడం సులభం, కానీ అది హానిరహితం కాదు. ప్రస్తుత MilliporeSigma భద్రతా డేటా షీట్ ఈ రంజకాన్ని తీవ్రమైన నోటి ద్వారా విషపూరితత Category 4గా, మింగితే హానికరమని వర్గీకరిస్తుంది. Sigma-Aldrich మిథిలీన్ బ్లూ SDS ప్రకారం ఆమోదించిన వ్యర్థ నిర్వహణ మార్గం ద్వారా పారవేయాలి. ఎథిడియం బ్రోమైడ్‌కు మరింత తీవ్రమైన జన్యు విషపూరితత హెచ్చరికలు ఉన్నాయి; దాని Sigma-Aldrich ఎథిడియం బ్రోమైడ్ SDSలో జనన కణాలపై అనుమానిత ప్రభావాలు కూడా పేర్కొనబడ్డాయి. Thermo Fisher న్యూక్లియిక్ ఆమ్ల రంజక మార్గదర్శినిలో తెలిపినట్లు, దాని జెల్‌లు, ద్రావణాలను సాధారణంగా ప్రమాదకర రసాయన వ్యర్థాలుగా వేరుచేస్తారు. రెండింటికీ SDS, సంస్థాగత నియమాలను అనుసరించండి. పొడి రంజకాన్ని గట్టిగా మూసి, పొడిగా ఉంచండి. విధానం అనుమతించిన మేరకే వాడుక రంజక ద్రావణాన్ని మళ్లీ ఉపయోగించండి. రంజనం చేసిన మెంబ్రేన్‌లను ఫిల్టర్ షీట్‌ల మధ్య పొడిగా నిల్వ చేయండి. బ్యాండ్‌లు వ్యాపించి కనుమరుగయ్యే ముందు జెల్‌ల ఫోటోలు తీయండి.

ప్రయోగశాల బెంచ్ వద్ద గుర్తుంచుకోవాల్సిన వాక్యం ఇదే. జెల్‌లు అధిక లోడింగ్ వద్ద తెల్ల కాంతిలో కనిపిస్తుందా అని పరీక్షిస్తాయి. ప్రోబ్ సున్నితమైన పని చేయడానికి ముందు మెంబ్రేన్‌లు బదిలీని, లోడింగ్‌ను పరీక్షిస్తాయి. పరిమిత సున్నితత్వం, తిరిగి విడిపోయే బంధం, కచ్చితమైన దశల క్రమంతో ఒకే రంజకం ఈ రెండు పనులకూ ఉపయోగపడుతుంది.