EMB అగార్‌పై E. coli మరియు ఇతర కాలనీల రూపాలను అర్థం చేసుకోవడం

ఒక విద్యార్థి తెలియని నమూనాను ఇయోసిన్ మిథిలీన్ బ్లూ అగార్‌పై గీతలుగా పూసి, రాత్రంతా ఇంక్యుబేట్ చేసి, తిరిగి వచ్చేసరికి ఆకుపచ్చ మెరుపుతో కూడిన ముదురు కాలనీలున్న ప్లేట్‌ను చూస్తాడు. నోట్‌బుక్‌లో "E. coli, నిర్ధారించబడింది" అని రాస్తాడు. ఆ నమోదు ప్లేట్ అందించే ఆధారానికి మించిన నిర్ణయాన్ని ప్రకటిస్తుంది. నిర్దిష్ట పరిస్థితుల్లో పెరుగుదల, కిణ్వన లక్షణాలను మాత్రమే ఆ ప్లేట్ చూపిస్తుంది. జాతిని గుర్తించడం వేరే నిర్ణయం; దానికి వేరే ఆధారాలు అవసరం.

ఈ మార్గదర్శిని EMB అగార్ ఫలితాలను అర్థం చేసుకోవాల్సిన అంశంగా పరిగణిస్తుంది. దీని వెనుక ఉన్న సూత్రాన్ని వివరిస్తుంది, నియంత్రణలతో కూడిన ఉదాహరణ ప్లేట్ల చిత్రసంకలనాన్ని పరిచయం చేస్తుంది, పాఠ్యపుస్తకంలోని రూపం తప్పుదారి పట్టించే సందర్భాలను తెలియజేస్తుంది.

ప్లేట్ వెనుక ఉన్న సూత్రం

EMB అగార్ ఎంపికాత్మకమైనదీ, భేదీకరణకు ఉపయోగపడేదీ. ఇయోసిన్ Y, మిథిలీన్ బ్లూ రంగులు అనేక గ్రామ్ పాజిటివ్ జీవుల పెరుగుదలను అణచివేస్తాయి కాబట్టి, ఈ మాధ్యమం గ్రామ్ నెగటివ్ జీవుల పెరుగుదలకు అనుకూలంగా ఉంటుంది. అవే రంగులు సూచికలుగానూ పనిచేస్తాయి: ఒక జీవి అందుబాటులో ఉన్న చక్కెరను కిణ్వనం చేసి, స్థానికంగా తగినంత ఆమ్లాన్ని ఉత్పత్తి చేసినప్పుడు, కాలనీ అధికంగా రంగును గ్రహించి ముదురు ఊదా నుంచి నీలి-నలుపు రంగులోకి మారుతుంది. ఆమ్ల ఉత్పత్తి తీవ్రంగా ఉంటే, కాలనీ ఉపరితలంపై లోహపు ఆకుపచ్చ రంగులో, చూసే కోణాన్ని బట్టి మారే మెరుపు కనిపించవచ్చు. ఇయోసిన్ మిథిలీన్ బ్లూ అగార్ ప్లేట్ల కోసం ASM విధానపత్రం ఎంపిక, భేదీకరణల ఈ కలయికను వివరిస్తూ బోధన కోసం సూచన ఛాయాచిత్రాలను అందిస్తుంది.

ఏ ఫలితాన్నైనా అర్థం చేసుకునే ముందు ఒక విషయం ముఖ్యం: ఏ కూర్పును ఉపయోగిస్తున్నారో తనిఖీ చేయండి. పాత Holt Harris Teague కూర్పులో లాక్టోస్‌తో పాటు సుక్రోస్ ఉంటుంది; Levine EMBలో లాక్టోస్ మాత్రమే ఉంటుంది. అనేక Serratia marcescens ఐసోలేట్ల మాదిరిగా, లాక్టోస్‌ను కాకుండా సుక్రోస్‌ను కిణ్వనం చేసే జీవి ఈ రెండు రకాల్లో వేర్వేరుగా కనిపించవచ్చు. EMB మాధ్యమాల తయారీదారు పత్రం ఈ కూర్పు వ్యత్యాసాన్ని స్పష్టంగా పేర్కొంటుంది. ఫలితంతో పాటు తయారీదారు, కూర్పు వివరాలను నోట్‌బుక్‌లో నమోదు చేయండి.

తయారుచేసిన, జీవులను ప్రవేశపెట్టని EMB అగార్ సాధారణంగా ఎరుపు-గోధుమ నుంచి ఎర్రటి ఊదా రంగులో ఉంటుంది; కొన్నిసార్లు ఆకుపచ్చ ఛాయ లేదా సూక్ష్మ అవక్షేపం ఉండవచ్చు. ఆ నేపథ్య రంగు పెరుగుదల కాదు. ప్రతి పరిశీలనను జీవులను ప్రవేశపెట్టని ప్లేట్‌తో లేదా నమోదు చేసిన ప్రాథమిక స్థితితో పోల్చండి. బోధన విధానపత్రం వేరుగా సూచించకపోతే, 35 నుంచి 37 C వద్ద వాయుసహిత పరిస్థితుల్లో సుమారు 18 నుంచి 24 గంటలు ఇంక్యుబేట్ చేసిన తర్వాత ప్రాథమిక ప్లేట్‌ను పరిశీలించండి. ఎక్కువసేపు ఇంక్యుబేట్ చేయడం వల్ల కిణ్వనం కనిపించే తీరు మారవచ్చు.

ప్లేట్‌ను ఎలా పరిశీలించాలి

రెండు రకాల కాంతిని ఉపయోగించండి. ముందుగా పరావర్తన లేదా ఏటవాలు కాంతిలో ప్లేట్‌ను పరిశీలించి, దాన్ని వంచండి: లోహపు మెరుపు చూసే కోణాన్ని బట్టి మారుతుంది; కనిపించవచ్చు లేదా కనిపించకుండా పోవచ్చు. తర్వాత కాలనీ రంగు, ముదురు మధ్యభాగాలను అంచనా వేయడానికి ప్లేట్ గుండా ప్రసరించే కాంతిలో పరిశీలించండి. బాగా విడివిడిగా ఉన్న కాలనీలను పరిశీలించండి; గుంపుగా ఉండటం, పక్కనున్న కాలనీలు స్థానిక ఆమ్ల సంచయాన్ని మార్చి రంగును తగ్గించవచ్చు లేదా ఎక్కువగా కనిపించేలా చేయవచ్చు. ASM చిత్రాల సమాహారం దీన్ని నేరుగా చూపిస్తుంది: మిశ్రమ కల్చర్‌లో చుట్టుపక్కల జీవులు ఆమ్ల వాతావరణాన్ని మార్చడం వల్ల E. coli ఆశించిన మెరుపును కోల్పోవచ్చు.

అభ్యాసంలో వీలున్నప్పుడల్లా నియంత్రణలను చేర్చండి. సాధారణ బోధన నియంత్రణల సమూహంలో నీలి-నలుపు రంగు, లోహపు మెరుపు లక్షణాల కోసం E. coli ATCC 25922; రంగులేని రూపం కోసం Salmonella Typhimurium ATCC 14028 లేదా Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 వంటి కిణ్వనం చేయని జీవి; నిరోధక నియంత్రణగా Enterococcus faecalis లేదా Staphylococcus aureus వంటి గ్రామ్ పాజిటివ్ జీవి ఉంటాయి. ఇవి EMB మాధ్యమాల ప్రామాణిక QC పట్టికల్లో పేర్కొనబడ్డాయి. పాజిటివ్ నియంత్రణలో మెరుపు లేకపోతే, తెలియని నమూనాపై సందేహించే ముందు ఇంక్యుబేషన్, కాలనీల కిక్కిరిసిన స్థితి లేదా కూర్పును సందేహించండి.

ఉదాహరణ ప్లేట్ల చిత్రసంకలనం

కింద ఉన్న ప్లేట్లు రూపొందించిన బొమ్మలు మాత్రమే; నిజమైన కల్చర్ల ఛాయాచిత్రాలు కావు. అవి ఏదైనా ఒక స్ట్రెయిన్ యొక్క కచ్చితమైన రంగు ఛాయను కాకుండా, గమనించాల్సిన నమూనాను చూపిస్తాయి. వాటిని ASM సూచన ఛాయాచిత్రాలతో, బోధన ప్రయోగశాలలోని నిజమైన ప్లేట్లతో పోల్చండి.

ప్లేట్ 1: EMB అగార్‌పై Escherichia coli, లాక్టోస్‌ను తీవ్రంగా కిణ్వనం చేసే జీవి

EMB అగార్‌పై E. coli సాధారణంగా ముదురు ఊదా నుంచి నీలి-నలుపు రంగులో ఉంటుంది. తరచుగా ముదురు మధ్యభాగం, తీవ్ర ఆమ్ల ఉత్పత్తి వల్ల ఏర్పడే లోహపు ఆకుపచ్చ మెరుపు ఉంటాయి. విద్యార్థులు వెతికే ప్రసిద్ధ లక్షణం ఈ మెరుపే, కానీ దాన్ని నిర్వచనంగా కాకుండా సహాయక ఆధారంగా పరిగణించండి. స్ట్రెయిన్, ఇంక్యుబేషన్ సమయం, కాలనీల సాంద్రత, చూసే కోణాన్ని బట్టి మెరుపు తీవ్రత మారుతుంది. మెరుపు లేకపోవడం E. coli కాదని నిరూపించదు; మెరుపు లేని ముదురు కాలనీ ఇతర అనేక కిణ్వన జీవులను సూచించవచ్చు. తదుపరి పరీక్షల కోసం కిక్కిరిసిన ప్రాంతం నుంచి అంచనా వేయకుండా, బాగా విడిగా ఉన్న కాలనీని ఎంచుకోండి.

ప్లేట్ 2: EMB అగార్‌పై Klebsiella pneumoniae, జిగురుగా ఉండే కిణ్వన జీవి

EMB అగార్‌పై Klebsiella pneumoniae సాధారణంగా పెద్దగా, తళతళలాడే, జిగురుగా ఉండే కాలనీలను ఏర్పరుస్తుంది. ఇవి గులాబీ-ఊదా నుంచి గోధుమ-ఊదా ఛాయల్లో ఉంటాయి; తరచుగా ముదురు మధ్యభాగాలు ఉంటాయి, కానీ సాధారణంగా బలమైన లోహపు మెరుపు ఉండదు. Enterobacter వంటి సంబంధిత కిణ్వన జీవుల్లోనూ ఇలాంటి ఆకృతి కనిపిస్తుంది. జిగురు స్వభావం, కాలనీ పరిమాణం కూడా పరిశీలనలో భాగమే: చిన్నగా, చదునుగా ఉన్న గులాబీ కాలనీకి ఇచ్చే ప్రాధాన్యం, పెద్దగా గుమ్మటంలా ఉబ్బిన జిగురు కాలనీకి ఇచ్చే ప్రాధాన్యం వేరుగా ఉంటుంది. E. coli విషయంలో మాదిరిగానే, ప్లేట్ ఒక కిణ్వన లక్షణాన్ని సూచిస్తుంది; జాతి స్థాయిలో పేరు నిర్ణయించడానికి కింద వివరించిన జీవరసాయన నిర్ధారణ అవసరం.

ప్లేట్ 3: EMB అగార్‌పై Salmonella మరియు ఇతర కిణ్వనం చేయని జీవులు, రంగులేని కాలనీలు

EMB అగార్‌పై Salmonella, అలాగే Shigella, అనేక Pseudomonas ఐసోలేట్లతో సహా లాక్టోస్‌ను కిణ్వనం చేయని సంబంధిత జీవులు సాధారణంగా రంగులేని నుంచి అర్ధపారదర్శక లేదా లేత అంబర్ రంగు కాలనీలుగా పెరుగుతాయి. కొన్ని కూర్పులు, పరిస్థితుల్లో స్వల్ప గులాబీ ఛాయ కనిపిస్తుంది; కాబట్టి లేత గులాబీ కాలనీని చూసినంత మాత్రాన అది కిణ్వన జీవి అని భావించకూడదు. EMB, Salmonellaను Shigella నుంచి లేదా ఇతర కిణ్వనం చేయని జీవుల నుంచి వేరు చేయదు; ఆ తేడాను తదుపరి పరీక్షలు నిర్ణయించాలి. E. coli లాంటి లోహపు మెరుపు కాలనీలను ఏర్పరిచే లాక్టోస్ పాజిటివ్ Salmonella స్ట్రెయిన్లు కూడా నమోదయ్యాయని గమనించండి. ఒకే ప్లేట్‌తో తుది నిర్ణయానికి రాలేమనడానికి ఇది మరో కారణం.

ప్లేట్ 4: Serratia marcescens మరియు కూర్పు వల్ల వచ్చే అపోహ

విద్యార్థులు తరచుగా ఎర్రటి కాలనీలను ఆశించి, ఆ తర్వాత ప్లేట్‌ను తప్పుగా అర్థం చేసుకుంటారు కాబట్టి Serratia marcescensకు ప్రత్యేక విభాగం అవసరం. చాలా క్లినికల్ ఐసోలేట్లు లాక్టోస్‌ను కిణ్వనం చేయవు; అందువల్ల Levine EMBపై అవి సాధారణంగా లేతగా లేదా స్వల్ప రంగుతో కనిపిస్తాయి. అనేక ఐసోలేట్లు సుక్రోస్‌ను కిణ్వనం చేస్తాయి కాబట్టి, సుక్రోస్ ఉన్న కూర్పులో మరింత ముదురు రంగు లేదా ఆమ్లంతో సంబంధం ఉన్న ప్రతిచర్య కనిపించవచ్చు. 35 నుంచి 37 C వద్ద సాధారణంగా తెలిసిన ఎర్రటి ప్రోడిజియోసిన్ వర్ణద్రవ్యాన్ని కూడా ఆశించకండి; ఇంక్యుబేటర్ ఉష్ణోగ్రత వద్ద వర్ణద్రవ్య ఉత్పత్తిపై ఆధారపడలేం. విధానపత్రంలో EMB అగార్‌పై Serratia marcescens గురించి పేర్కొన్నప్పుడు, ఆ వివరణ ఏ కూర్పును ఉద్దేశిస్తుందో తనిఖీ చేయండి. Serratia జీవక్రియపై సమీక్ష ఈ అపోహకు కారణమయ్యే లాక్టోస్ నెగటివ్, సుక్రోస్ విషయంలో మార్పులు ఉండే నమూనాను వివరిస్తుంది.

ప్లేట్ 5: నియంత్రణలు మరియు నిరోధించబడిన జీవులు

Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, Bacillus వంటి గ్రామ్ పాజిటివ్ జీవులు సాధారణంగా EMB అగార్‌పై నిరోధించబడతాయి లేదా వాటి పెరుగుదల గణనీయంగా అణచివేయబడుతుంది. అయితే ప్రతి స్ట్రెయిన్‌కు నిరోధం సంపూర్ణంగా ఉండదు. నియంత్రణల సమూహం పరిశీలన విశ్వసనీయతను కాపాడుతుంది: E. coli నియంత్రణ నీలి-నలుపు రంగు, మెరుపుతో మంచి పెరుగుదలను చూపాలి; కిణ్వనం చేయని జీవి నియంత్రణ రంగులేని పెరుగుదలను చూపాలి; నిరోధక నియంత్రణలో చాలా తక్కువ పెరుగుదల లేదా అసలు పెరుగుదల ఉండకూడదు. నిరోధక నియంత్రణ బాగా పెరిగితే, ఎంపికాత్మక దశ విఫలమైనట్లే; ఆ బ్యాచ్‌లోని మిగతా ప్రతి పరిశీలనపై సందేహం ఉంటుంది. రంగు వేసే పద్ధతులు, కల్చర్ మాధ్యమాలు వేర్వేరు ప్రశ్నలకు సమాధానమిస్తాయి; ప్రయోగశాలలో స్లైడ్‌లకు రంగు వేయడం గురించి తెలుసుకోవడానికి మిథిలీన్ బ్లూ రంగు ప్రక్రియ చిత్రసంకలనాన్ని చూడండి.

పరిమితులతో కూడిన పోలిక

తప్పుదారి పట్టించే రూపాలను మూడు వాక్యాల్లో సంగ్రహించవచ్చు. ముదురు రంగు అంటే E. coli అని కాదు; ఎందుకంటే Klebsiella, Enterobacter, ఇతర కిణ్వన జీవులు మెరుపు లేకుండానే ముదురు మధ్యభాగాలను ఏర్పరుస్తాయి. గులాబీ రంగు అంటే Klebsiella అని కాదు; ఎందుకంటే మధ్యస్థంగా లేదా నెమ్మదిగా కిణ్వనం చేసే జీవులు, సాధారణంగా కిణ్వనం చేయనివిగా పరిగణించే కొన్ని జీవులు కూడా గులాబీ లేదా లేత ఊదా రంగులో కనిపిస్తాయి. మెరుపు అంటే కచ్చితంగా E. coli అని కాదు; ఎందుకంటే తీవ్రంగా కిణ్వనం చేసే ఇతర జీవులూ దాన్ని ఉత్పత్తి చేయవచ్చు. బోధన విధానపత్రం, అందులోని మిశ్రమ కల్చర్ చిత్రాలు ఈ పొరపాట్లను ఒక్కొక్కటిగా చూపిస్తాయి.

నిర్ధారణ పరిమితులు

EMB అగార్ ఒక లక్షణరూపాన్ని తెలియజేస్తుంది, జాతిని కాదు. వేర్వేరు జీవులు ఒకే కాలనీ రూపాన్ని చూపవచ్చు. అలాగే స్ట్రెయిన్, వయస్సు, కిక్కిరిసిన స్థితి, కూర్పు, ఇంక్యుబేషన్ కారణంగా ఒక జీవి తన పాఠ్యపుస్తక రూపానికి భిన్నంగా కనిపించవచ్చు. అందుకే బోధన, క్లినికల్ కార్యవిధానాల్లో EMB ఆకృతిని ప్రాథమిక అంచనాగా పరిగణిస్తారు.

ఆధారాలతో సమర్థించగల విద్యార్థి కార్యవిధానం ఇలా ఉంటుంది: విడిగా ఉన్న కాలనీని వివరించండి — పరిమాణం, రంగు, మధ్యభాగం, ఏటవాలు కాంతిలో మెరుపు, జిగురు స్వభావం; కూర్పు, ఇంక్యుబేషన్ సమయం, ఉష్ణోగ్రత, నియంత్రణలను నమోదు చేయండి; ఆ తర్వాత ఏ నిర్ధారణ పరీక్షకైనా ముందు బాగా విడిగా ఉన్న కాలనీని ఉపకల్చర్ చేసి స్వచ్ఛమైన కల్చర్ పొందండి. సాధారణ తదుపరి పరీక్షల్లో E. coli, కోలిఫారమ్‌ల ప్రాథమిక గుర్తింపు కోసం గ్రామ్ స్టెయిన్‌తో పాటు IMViC ప్రతిచర్యలు; పేగు సంబంధిత జీవుల కోసం TSI లేదా KIA, జీవికి నిర్దిష్టమైన జీవరసాయన పరీక్షల సమూహాలు ఉంటాయి. పని అవసరాన్ని బట్టి సీరాలజీ, MALDI TOF లేదా ఇతర ధ్రువీకరించిన గుర్తింపు పద్ధతులను ఉపయోగిస్తారు. ఎంపికాత్మక, భేదీకరణ పేగు సంబంధిత మాధ్యమాల మధ్య EMB స్థానాన్ని అర్థం చేసుకోవడానికి పేగు సంబంధిత కల్చర్ మాధ్యమాల పరిచయాలను, గ్రామ్ స్టెయిన్ తర్వాతి పరీక్షలను చూడండి. నీలి రంగుతో సిద్ధం చేసిన స్లైడ్ ఏమి నిరూపించగలదు, ఏమి నిరూపించలేదు అనే సంబంధిత ప్రశ్నకు, మిథిలీన్ బ్లూ రంగు ప్రక్రియ చిత్రసంకలనం కూడా ఇదే దృక్పథంతో పరిశీలనను, నిర్ణయాన్ని వేరుగా ఉంచుతుంది.

నిర్ణయం రాసే ముందు పరిశీలనను రాయండి. "24 గంటలకు Levine EMBపై, చూసే కోణాన్ని బట్టి మారే ఆకుపచ్చ మెరుపుతో ముదురు నీలి-నలుపు కాలనీలు; తీవ్ర లాక్టోస్ కిణ్వనానికి అనుగుణంగా ఉన్నాయి" అనే నమోదు ఆధారాలతో సమర్థించదగినది. "E. coli, నిర్ధారించబడింది" అని రాయాలంటే, ప్లేట్ ఒక్కటే అందించలేని నిర్ధారణ దశ అవసరం.