Mbadala za methylene blue kwa uchunguzi wa hadubini: chagua kulingana na kazi

Kwa smear rahisi ya bakteria, crystal violet inaweza kuchukua nafasi ya methylene blue wakati lengo ni kuona umbo la seli. Kwa seli hai, mbadala bora unaweza kuwa phase contrast bila kutumia rangi yoyote. Uchaguzi hutegemea uchunguzi unaohitaji kufanya.

Tuseme watu wawili wanachunguza culture ileile ya bakteria. Mmoja anataka kutofautisha seli zenye umbo la vijiti na seli za mviringo. Mwingine anataka kujua kama matibabu yameua bakteria. Rangi inayompa mtu wa kwanza picha iliyo wazi inaweza isimpe mtu wa pili jibu lolote linaloweza kutumika.

Kabla ya kuchagua mbadala, kamilisha sentensi hii: “Ninahitaji kuchunguza ___ katika ___, na seli lazima / si lazima zibaki hai.” Sentensi hiyo hufafanua kazi ambayo rangi inapaswa kufanya.

Anza na sampuli na swali

Kwanza amua kama seli lazima zibaki hai, kisha tambua kipengele unachohitaji kuchunguza:

• Seli lazima zibaki hai: kwa mwendo au umbo, fikiria phase contrast bila rangi au DIC; kwa DNA ya kiini, fikiria Hoechst 33342 pamoja na fluorescence; kwa uadilifu wa utando, chagua assay iliyothibitishwa kama SYTO 9 pamoja na propidium iodide.
• Seli si lazima zibaki hai: kwa mofolojia ya bakteria, fikiria simple stain ya crystal violet au negative stain ya nigrosin; kwa Gram reaction, tumia mbinu kamili ya Gram stain; kwa DNA ya kiini katika seli zilizofikishwa, fikiria fluorescence ya DAPI.

Tumia jedwali hili kulinganisha vikwazo vya kila njia. Hizi ni chaguo za mbinu, si maagizo ya kubadilishana chupa ndani ya protokali iliyopo.

Kwa smear rahisi, badilisha mbinu kwa uangalifu

Crystal violet ni chaguo la vitendo wakati kazi ni kupata mwonekano wa rangi moja wa mofolojia ya bakteria. Bacteriological Analytical Manual ya FDA inaorodhesha formulation mbili za crystal violet zinazofaa kwa simple staining. Tumia formulation iliyoandikwa vizuri pamoja na mbinu yake ya maandalizi; jina la rangi pekee halibainishi reagenti inayofaa kutumika.

Crystal violet pia hutumika katika Gram staining, lakini hilo halifanyi simple stain ya crystal violet kuwa Gram stain. Katika protokali ya Gram stain ya ASM, matokeo ya utofautishaji hutegemea crystal violet, iodine, decolorization, na counterstaining kufanya kazi kwa mfuatano. Kuacha hatua hizo hubadilisha kile ambacho picha inaweza kuthibitisha. Tazama simple staining dhidi ya Gram staining kwa tofauti hiyo.

Nigrosin hutoa njia tofauti ya kuonyesha mipaka: hufanya mandharinyuma kuwa meusi huku seli za bakteria zikibaki na mwonekano mwepesi zaidi kwa kulinganisha. Kuna jambo muhimu katika maagizo ya nigrosin ya Merck ambalo orodha ya jumla ya mbadala inaweza kukosa. Formulation yake iliyobainishwa ya matumizi ina formaldehyde. Kwa hiyo huwezi kuhitimisha kuwa inafaa kwa seli hai kwa kutegemea maneno “negative stain,” hata kama seli zenyewe zinaonekana kutotiwa rangi. Kagua formulation kamili na maandalizi ya sampuli.

Kwa sampuli hai, fikiria kubadilisha optics

Ikiwa unataka kutazama seli zikisogea au kugawanyika, kuongeza rangi nyingine kunaweza kufanya uchunguzi kuwa mgumu zaidi. Kama Nikon inavyoeleza katika mwongozo wake kuhusu contrast katika sampuli zenye uwazi, phase contrast na differential interference contrast, au DIC, hufanya sampuli zionekane kupitia tofauti katika sifa zao za optical. Zinaweza kuonyesha seli hai zisizotiwa rangi, mradi hadubini iwe na vipengele vinavyohitajika.

Chaguo hili huhifadhi maandalizi yasiyotiwa rangi, lakini hubadilisha aina ya taarifa inayopatikana. Unaweza kufuatilia mpaka au mwendo bila kujua ni molekuli gani iliyotengeneza contrast. Ikiwa swali linahusu mahali molekuli ilipo, chagua mbinu inayofaa ya labeling badala yake.

Kwa DNA ya kiini, ulinganisho wa DAPI na Hoechst stains wa Invitrogen unatofautisha matumizi ya kawaida ya DAPI kwa seli zilizofikishwa na Hoechst 33342, ambayo hupenya seli kwa urahisi zaidi na hupendelewa kwa labeling ya seli hai. Zote zinahitaji vifaa vya fluorescence. Hakuna kati ya hizo ambayo ni mbadala wa moja kwa moja wa rangi yenye kuonekana katika brightfield.

Chukulia muda wa kukabiliwa na rangi na mwanga kama hali za majaribio. Linganisha maandalizi yaliyotiwa rangi na yasiyotiwa rangi wakati tabia ya seli ndiyo kipimo chako.

Seli nyekundu si lazima iwe seli iliyokufa

SYTO 9 na propidium iodide mara nyingi hutumika pamoja kutathmini uadilifu wa utando wa bakteria. Mwongozo wa BacLight unahusisha utando usioharibika na staining ya kijani, na utando ulioharibika na staining ya nyekundu. Tafsiri hiyo inahitaji kuthibitishwa kwa sampuli husika.

Utafiti wa 2019 wa Rosenberg na wenzake unaonyesha tatizo hilo. Katika biofilms za E. coli za saa 24 kwenye kioo ndani ya phosphate-buffered saline, takriban 96% ya seli zilionekana kuwa propidium-iodide-positive in situ. Hata hivyo, waandishi walikadiria kuwa 82% ziliweza kukuzwa baada ya kuvunwa. Picha za confocal zilionyesha seli zenye sehemu za ndani za kijani chini ya nyenzo iliyotiwa rangi nyekundu, jambo lililoashiria nucleic acids za nje ya seli kama chanzo cha ishara inayoweza kupotosha.

Asilimia hizo zinaelezea vipimo tofauti kwenye maandalizi ya utafiti huo, si kipengele cha marekebisho kinachotumika kila mahali. Funzo muhimu ni kuangalia kilichozalisha ishara. Katika biofilm, rangi ya nucleic acid inaweza kugundua nyenzo zilizo nje ya seli pamoja na zilizo ndani ya seli zilizoharibika. Kwa hitimisho kuhusu uhai, watafiti wanapendekeza vipimo vinavyokamilishana, kama cultivation au metabolic activity, huku wakikubali kuwa kila kimoja kina vikwazo.

Kagua mbadala una nini hasa

Mbinu mbadala ya staining bado inaweza kuwa na methylene blue. Giemsa ni mfano: Merck inaelezea bidhaa yake kama azure-eosin-methylene-blue solution, inayokusudiwa kwa matumizi yanayojumuisha smear za damu na uboho. Inaweza kuwa mbinu tofauti kwa sampuli tofauti, lakini haitimizi sharti la kutotumia methylene blue.

Ikiwa kuondoa compound fulani ni sehemu ya jaribio, kagua utambulisho wa reagenti na formulation kabla ya kulinganisha picha. Mwongozo kuhusu methyl blue, methylene blue, na rangi zenye majina yanayofanana unaelezea tofauti za majina.

Thibitisha ubadilishaji kabla ya kutumia matokeo

Kwa mbinu mpya, fanya ulinganisho mdogo kwa kutumia sampuli zinazowakilisha vizuri na control inayofaa. Weka mipangilio ya hadubini ikilingana kadiri inavyowezekana. Rekodi formulation ya reagenti, maandalizi ya sampuli, exposure, na hali za upigaji picha ili picha inayoonekana bora zaidi iweze kuchunguzwa badala ya kupendelewa tu.

Pima mafanikio kwa kulinganisha na swali la awali. Kwa mofolojia, tathmini kama mipaka na mpangilio wa seli bado vinaweza kufasiriwa. Kwa nuclear labeling, tathmini eneo la ishara na mandharinyuma. Kwa uhai, hitaji ushahidi zaidi ya mgawanyiko wa rangi unaovutia. Mwongozo mpana zaidi kuhusu methylene blue staining na matumizi ya maabara unaeleza jinsi uchunguzi na maandalizi yanavyohusiana.

Chagua mbadala unaohifadhi kipimo unachohitaji. Rangi ni sifa moja tu ya picha inayopatikana.