Je, bluu ya methilini inaweza kupita pembeni ya Kompleksi III ya mitokondria? Kwa nini tafiti zinatofautiana

Maabara mbili ziliuliza kama bluu ya methilini inaweza kupita pembeni ya Kompleksi III ya mitokondria iliyozuiwa. Moja ilijibu hapana. Nyingine ilijibu ndiyo. Zote zilikuwa na data.

Utafiti wa kwanza, katika mitokondria za ubongo wa panya wadogo, uligundua kuwa rangi hiyo haiwezi kufanya hivyo. Wa pili, katika mitokondria za ubongo kutoka spishi tatu za wanyama wagugunaji, uligundua kuwa inaweza kufanya hivyo kwa kiasi fulani. Utafiti wa tatu, katika ini la panya wadogo, mara nyingi hutajwa pamoja nazo lakini ulijaribu jambo tofauti. Ukiuweka katika muktadha wake, nusu ya mkanganyiko inaondoka.

Hakuna utaratibu mmoja unaotumika katika hali zote wa kutangaza. Kuna majaribio matatu yenye vizuizi, dozi na vipimo tofauti. Soma hali za majaribio kwanza. Hitimisho linafuata.

Kupita pembeni kunamaanisha nini hapa

Elektroni huingia katika mnyororo kupitia Kompleksi I (kutoka NADH) au Kompleksi II (kutoka suksinati), hupitia Kompleksi III hadi sitokromu c, kisha hupitia Kompleksi IV hadi oksijeni. Tofauti ya mkusanyiko inayojengwa njiani ndiyo seli hutumia kutengeneza ATP.

Dai la kupita pembeni linasema kuwa bluu ya methilini hupokea elektroni kabla ya sehemu iliyozuiwa na kuzikabidhi baada yake. Rangi iliyooksidishwa hupokea elektroni kutoka NADH au vipengele vya mwanzo vya mnyororo, na kuwa leukomethilini bluu, kisha umbo lililoredukishwa huzikabidhi kwa sitokromu c au kuzirudisha katika mnyororo. Ikiwa ukabidhiano huo unafanyika baada ya sehemu iliyozuiwa, upumuaji na potenshali ya utando hurejea kwa kiasi fulani. Ikiwa unafanyika kwenye sehemu iliyozuiwa au kabla yake, hakuna kinachorejea.

Kipengele kimoja cha Kompleksi III kinaamua sehemu kubwa ya ubishi huu. Kompleksi hiyo huendesha mzunguko wa Q wenye maeneo mawili ya kufungamana kwa vizuizi. Antimycin hufungamana kwenye eneo la Qi. Myxothiazol hufungamana kwenye eneo la Qo. Utafiti unaotumia kimoja tu kati ya hivyo umejaribu nusu tu ya kompleksi.

Utafiti wa kwanza: hakuna kupita pembeni katika mitokondria za ubongo wa panya wadogo

Gureev na wenzake walitumia mitokondria za gamba la ubongo kutoka panya wadogo wa C57BL/6, zilizotengwa kwa digitonin, na kupimwa katika 0.1 mg ya protini per ml. Substrati zilihusisha mipangilio mitatu: piruvati pamoja na malati katika 5 mM kila moja, suksinati katika 10 mM pamoja na glutamati katika 2 mM, na L-prolini katika 10 mM. Vizuizi vilikuwa rotenone katika 1 micromolar (Kompleksi I) na antimycin katika 1 microgram per ml (Kompleksi III). Dozi za rangi zilikuwa 0.5, 1, na 2 micromolar, huku 1 micromolar ikiwa mkusanyiko mkuu. Mbinu na mikondo ya vipimo zimo katika taarifa ya FEBS Letters.

Kupita pembeni ya Kompleksi I kulifanya kazi. Rotenone ilipunguza upumuaji uliochochewa na ADP kutoka takriban 121 hadi takriban 2 nmol per minute per mg, na rangi katika 1 micromolar iliurejesha hadi takriban 21. Potenshali ya utando ilirejea kwa piruvati pamoja na malati na kwa L-prolini.

Kupita pembeni ya Kompleksi III hakukufanya kazi. Antimycin ilipunguza upumuaji hadi takriban 16, na rangi iliuongeza hadi takriban 20 tu. Potenshali ya utando haikurejea kwa substrati yoyote, katika dozi za rangi hadi 5 micromolar. Data za peroksidi zilionyesha jambo lilelile: rangi pekee iliongeza utoaji wa peroksidi kutoka kiwango cha msingi cha karibu 76 pmol per minute per mg hadi takriban 1170, 1460, na 1945 katika dozi hizo tatu, lakini antimycin ilipunguza ishara hiyo iliyosababishwa na rangi kwa takriban asilimia 25, 88, na 96, mtawalia. Ikiwa rangi iliyoredukishwa ingeathiriana moja kwa moja na oksijeni, kuzuia Kompleksi III hakupaswi kupunguza ishara hiyo. Waandishi walihitimisha kuwa rangi iliyoredukishwa huoksidishwa kwenye eneo la Qo la Kompleksi III, kabla ya sehemu iliyozuiwa na antimycin. Mzunguko mfupi, kwa maneno: watoaji kwenda kwa rangi, rangi kwenda kwa Qo, kisha njia ya kawaida kuendelea mbele. Rotenone hupitwa pembeni. Antimycin haipitwi pembeni.

Utafiti wa pili: kupita pembeni kwa kiasi fulani katika spishi tatu, kwenye maeneo yote mawili ya vizuizi

Svab na wenzake walipanua muundo wa majaribio. Walitumia mitokondria za ubongo kutoka panya wadogo, panya wakubwa na nguruwe wa Guinea, zilizotengwa kwa Percoll, na kupimwa katika kiwango kilekile cha 0.1 mg per ml, kwa piruvati pamoja na malati au glutamati pamoja na malati katika 5 mM kila moja. Walitumia vizuizi viwili vya Kompleksi III: antimycin A katika 0.3 micromolar na myxothiazol katika 1 micromolar. Rangi ilikuwa katika 2 micromolar katika vipimo vingi, na 0.5 katika majaribio ya sitokromu c. Spishi zote tatu zilizopimwa kwa taratibu zinazolingana zimo katika makala inayopatikana kwa ufikiaji huria.

Sehemu zote mbili zilizozuiwa zilipitishwa pembeni kwa kiasi fulani, katika spishi zote tatu. Katika mitokondria za panya wadogo, antimycin ilipunguza upumuaji na rangi iliuongeza kwa takriban asilimia 60, kutoka karibu 37 hadi 59 nmol per minute per mg. Myxothiazol iliupunguza kwa asilimia 88, hadi takriban 4.5, na rangi iliuongeza mara tano hadi takriban 23. Potenshali ya utando ilirejea kwa kiasi fulani chini ya kila kizuizi, ikipimwa kwa rangi mbili (safranin O na TMRM ya uwiano) ili kuondoa uwezekano wa athari potofu za vipimo vya mwanga.

Makala hii pia ilijaribu ukabidhiano huo moja kwa moja, jambo ambalo utafiti wa kwanza haukufanya kamwe. Sitokromu c yenye vikundi vya asetili iliyoongezwa kutoka nje katika 25 micromolar haikuredukishwa na mitokondria zenye hali ya nishati, iwe vizuizi vilikuwepo au la, lakini kuongeza rangi kulichochea uredukishaji katika hali zote mbili. Katika myeyusho wa bufa usio na seli, NADH pamoja na rangi iliredukisha sitokromu c kwa kasi iliyolingana na kiasi cha NADH. Mruko mrefu zaidi, kwa maneno: ekwivalenti za uredukishaji kwenda kwa rangi, rangi moja kwa moja kwenda kwa sitokromu c, Kompleksi IV kwenda kwa oksijeni. Njia hiyo inaruka Kompleksi III kabisa, kwa hiyo vizuizi vyote viwili vinaweza kupitwa pembeni.

Vipimo viwili vya ziada vinaunga mkono tafsiri hiyo. Fluoresensi ya NAD(P)H ilipungua rangi ilipoongezwa katika mitokondria zilizotibiwa kwa myxothiazol, ikimaanisha kuwa ekwivalenti za uredukishaji zilitiririka kupitia njia mpya. Na ufyonzaji wa mwanga wa rangi katika 660 nm ulifuatilia kila nyongeza kwa zamu, huku vimiminika vya juu baada ya kutenganishwa kwa sentrifuji vikionyesha kuwa rangi iliyooksidishwa ilikusanyika ndani ya mitokondria zenye hali ya nishati kwa zaidi ya mara mia moja, kisha ikaondoka potenshali ilipoporomoka. Uwiano wa protoni pia unalingana: kuruka hatua za kusukuma protoni huacha takriban protoni 2 kwa kila jozi ya elektroni badala ya 10, kwa hiyo matumizi ya oksijeni ya haraka zaidi pamoja na urejeaji wa potenshali kwa kiasi fulani tu ndiyo sura ya njia halisi ya kupita pembeni, si ushahidi dhidi yake.

Maandalizi yaleyale yalitoa miitikio ambayo inaweza kupotosha anayesoma juu juu. Kwa kizuizi pamoja na rangi, ADP ilipunguza upumuaji badala ya kuuongeza, na kuzuia usafirishaji kuliuchochea badala ya kuupunguza, huku potenshali ya utando ikiendelea kubadilika katika mielekeo ya kawaida. Matumizi ya oksijeni pekee yanapotosha katika mfumo huu.

Utafiti wa tatu: utafiti wa ini uliojaribu Kompleksi I na II, si III

Lee na Boelsterli walitumia mitokondria za ini la panya wadogo na hepatositi zilizokuzwa maabara, zilizoharibiwa na efavirenz (Kompleksi I, IC50 karibu 30 micromolar) na hydrazine, metaboliti ya isoniazid (Kompleksi II, IC50 karibu 30 micromolar). Rangi katika takriban 30 micromolar ilirejesha uoksidishaji wa NADH, potenshali ya utando na ATP, huku ikipunguza vioksidishaji na kifo cha seli kwa nekrosisi. Makala ya Redox Biology inaeleza hili kwa mfano wa rangi inayobeba elektroni kupita pembeni ya Kompleksi I na II zilizoharibiwa.

Matokeo hayo ni muktadha uliothibitishwa kuhusu sehemu za awali za mnyororo, na hayasemi chochote kuhusu Kompleksi III kwa sababu hakuna sehemu yake iliyozuiwa katika utafiti huo. Hayawezi kuthibitisha wala kukanusha utafiti wowote kati ya tafiti hizo mbili za ubongo.

Jedwali la hali za majaribio

Sababu nne zinazoweza kufanya tafiti zote mbili za Kompleksi III kuwa sahihi kuhusu mipangilio yao wenyewe

1. Kizuizi hakikuwa hatua ileile ya majaribio. Antimycin pekee katika 1 microgram per ml ikilinganishwa na antimycin katika 0.3 micromolar pamoja na kizuizi tofauti cha eneo la Qo. Njia ya rangi inayopeleka elektroni kwenye eneo la Qo hushindwa pale ambapo njia ya moja kwa moja kwenda kwa sitokromu c hufaulu. Eneo moja haliwezi kuwakilisha yote mawili.

2. Dozi ya rangi na muda vilitofautiana. Mikusanyiko mikuu ya 1 ikilinganishwa na 2 micromolar, kwa dutu inayozunguka kati ya hali za redoksi ambayo uchukuaji wake na uredukishaji wa moja kwa moja wa sitokromu c hutegemea mkusanyiko na muda. Tofauti ndogo za dozi pamoja na tofauti za wakati wa kupima zinaweza kufichua matawi tofauti ya mtandao mmoja.

3. Maandalizi yalitofautiana. Kutenga kwa digitonin ikilinganishwa na kutenga kwa gradieni ya Percoll huchagua makundi ya mitokondria yanayoingiliana lakini yasiyofanana kabisa. Mkusanyiko wa protini ulilingana katika 0.1 mg per ml, kwa hiyo kigezo hicho hakielezi tofauti, lakini vikundi vidogo na uadilifu wa mitokondria bado vinaweza kuieleza. Na shaka kuhusu spishi iliondolewa: kundi la pili lilizalisha tena mwitikio wake katika panya wadogo pia.

4. Hali ya substrati huamua kile ambacho rangi inaweza kufanya. Mipangilio mitatu ya substrati ikilinganishwa na jozi zinazohusiana na NADH. Upatikanaji wa NADH na potenshali ya utando kwa pamoja huamua kasi ya uredukishaji wa rangi na jinsi inavyogawanyika katika sehemu mbalimbali, na njia inayohitaji rangi iliyoredukishwa karibu na sitokromu c iliyooksidishwa hutegemea uchaguzi huo.

Jinsi ya kusoma dai linalofuata la kupita pembeni

Uliza ni kompleksi gani iliyozuiwa, kwa kizuizi gani, kwenye eneo gani na kwa dozi gani. Uliza mkusanyiko wa rangi na wakati kipimo kilichukuliwa. Uliza kuhusu tishu, spishi, utengaji, mkusanyiko wa protini na substrati. Na uliza kama potenshali, upumuaji, hali ya redoksi na kipimo cha ukabidhiano wa moja kwa moja vinakubaliana, kwa sababu matumizi ya oksijeni pekee yalielekeza kwenye hitimisho lisilo sahihi zaidi ya mara moja hapa.

Muhtasari wenye mipaka hiyo unabaki sahihi. Kupita kwa rangi pembeni ya Kompleksi I kunakubaliwa. Kwa Kompleksi III, mitokondria za panya wadogo zenye antimycin katika 1 microgram per ml na rangi katika 1 micromolar hazionyeshi kupita pembeni kunakorejesha utendaji, ilhali spishi tatu zenye antimycin katika 0.3 micromolar au myxothiazol katika 1 micromolar na rangi katika 2 micromolar zinaonyesha kupita pembeni kwa kiasi fulani, pamoja na uhamishaji wa moja kwa moja kutoka kwa rangi kwenda kwa sitokromu c. Kauli hizo zinaweza kuwa sahihi kwa pamoja. Chochote kinachozidi hapo ni upanuzi wa hitimisho nje ya data.

Usomaji unaohusiana huweka dai linalobishaniwa ndani ya kemia isiyobishaniwa: jinsi bluu ya methilini inavyohamisha elektroni kwa mfumo wa kupokezana elektroni, majaribio ya kupita pembeni ya Kompleksi I kwa hali iliyothibitishwa ya sehemu za awali za mnyororo, vipimo vya potenshali ya utando na athari zake potofu kwa sababu rangi mbili zilihitajika, na ushughulikiaji wa dutu zinazozunguka kati ya hali za redoksi maabara kwa mitego ya dozi na muda.