Bluu ya methilini na ferroptosisi: utaratibu wa peroksidesheni ya lipidi

Ferroptosisi ni kifo cha seli kinachosababishwa na uharibifu wa utando. Mafuta yenye vifungo vingi viwili katika utando huoksidishwa katika mmenyuko wa mnyororo, utando hushindwa kufanya kazi, na seli hufa. Chuma kinahitajika katika mchakato huo wa kikemia. Sentensi hiyo ndiyo dhana nzima, na kila jambo katika makala hii ni jaribio la sehemu moja yake.

Swali hapa ni mahsusi zaidi: bluu ya methilini hufanya nini kwa mnyororo huo katika majaribio ya seli, na matokeo hayo yanaonyesha nini hasa. Jibu fupi ni kwamba katika tafiti mbili za maabara, bluu ya methilini katika viwango vya nanomolar ilipunguza peroksidesheni ya lipidi za mitokondria na kuzifanya seli zibaki hai baada ya kuwekwa kwenye vichochezi ambavyo vingesababisha ferroptosisi bila hatua hiyo. Jibu refu lina umuhimu zaidi, kwa sababu kila kiungo cha mnyororo kilijaribiwa kwa hatua tofauti, na kila hatua ina mipaka yake.

Ferroptosisi katika aya moja

Fosfolipidi ya utando yenye mkia wa asidi ya mafuta yenye vifungo vingi viwili ina sehemu dhaifu: atomi za hidrojeni ambazo ni rahisi kuondoa. Radikali inapoondoa moja, oksijeni huungana na lipidi, radikali ya peroksili ya lipidi huundwa, na radikali hiyo huondoa hidrojeni kutoka kwenye lipidi inayofuata. Mmenyuko huenea kwenye utando isipokuwa kitu fulani kiuzuie.

Kizuizi kikuu ni kimeng'enya kinachoitwa GPX4, ambacho hutumia glutathioni kureduksi peroksidi za lipidi na kuzigeuza kuwa alkoholi za lipidi zisizo na madhara. Vichochezi vya maabara hushambulia ulinzi huu katika sehemu maalumu. Erastin huzuia uingizaji wa sistini kupitia mfumo wa xc-minus, na hivyo kuinyima seli sisteini inayohitajika kutengeneza glutathioni. Buthionine sulfoximine huzuia moja kwa moja utengenezaji wa glutathioni. RSL3 huzuia GPX4 yenyewe. Vyote vitatu huacha peroksidi bila kuondolewa, lakini hufanya hivyo katika hatua tofauti, kwa hiyo matokeo ya kichochezi kimoja hayawezi kuchukuliwa moja kwa moja kuwa yanatumika kwa vingine.

Ferroptosisi hutofautiana na apoptosisi kwa sifa zinazoifafanua. Haina mfululizo wa uanzishaji wa kaspasi wala miili ya apoptosisi. Vifungaji vya chuma kama deferoxamine na mawakala wanaonasa radikali kama ferrostatin-1 huikandamiza; huo ndio mtihani wa kiutendaji ambao watafiti hutumia kutambua kifo kuwa cha ferroptosisi badala ya kuwa nekrosisi tu. Mtazamo mpana wa njia za kifo cha seli kinachodhibitiwa unaweka tofauti hii katika muktadha, na jinsi seli zinavyoshughulikia chuma kinachoweza kushiriki kwa urahisi katika miitikio ya kikemia inaeleza kwa nini ufungaji wa chuma ni kidhibiti muhimu sana.

Nafasi ya mitokondria, na kwa nini ilibishaniwa

Tafiti za awali ziliripoti kwamba seli zisizo na DNA ya mitokondria bado hupitia ferroptosisi, jambo lililoashiria kuwa mitokondria si lazima iwepo. Tafiti za baadaye ziligundua kwamba kupunguza mitokondria, au kuzuia upumuaji wa seli, kunaweza kukandamiza ferroptosisi inayotokana na upungufu wa sisteini lakini si ile inayotokana na kuzuiwa moja kwa moja kwa GPX4. Matokeo yote mawili yanaweza kuwa sahihi ikiwa mchango wa mitokondria unategemea kichochezi, aina ya seli, na mahali peroksidesheni inayoamua matokeo inapotokea.

Utafiti ambao ni msingi wa makala hii ulishughulikia mjadala huo kwa kutumia kichunguzi mahsusi kwa sehemu fulani ya seli. MitoCLox ni toleo linalolenga mitokondria la kiashiria cha peroksidesheni ya lipidi: hubadilisha fluoresensi kinapokutana na radikali za peroksili ya lipidi ndani ya mitokondria. Katika fibroblasti zilizowekwa kwenye erastin, oksidesheni ya kichunguzi cha mitokondria ilionekana katika seli zilizokuwa bado hai kabla ya kifo, na ilitofautiana kati ya seli katika kundi hilo. Mpangilio huo wa wakati ni muhimu. Peroksidesheni inayotangulia kifo ni sababu inayowezekana. Peroksidesheni inayopimwa katika seli zilizokufa tu ni mabaki. Mwongozo unaoandamana na makala hii kuhusu vipimo vya peroksidesheni ya lipidi na kile ambacho kila kichunguzi huripoti unaeleza kwa nini eneo la kichunguzi huamua maana ya ishara.

Mfumo huo huo ulionekana katika modeli ya pili. Fibroblasti kutoka kwa mgonjwa mwenye neuropathia ya kurithi ya neva ya macho ya Leber, ambazo zina mabadiliko ya kijeni katika kompleksi I na mkazo wa kioksidishaji wa awali ulio juu zaidi, zilikufa kwa ferroptosisi glutathioni ilipopunguzwa, ilhali fibroblasti za udhibiti zilistahimili. Oksidesheni ya kichunguzi cha mitokondria ilitangulia tena. Maelezo yanapatikana katika utafiti wa fibroblasti kuhusu peroksidesheni ya lipidi za mitokondria katika ferroptosisi.

Kile ambacho bluu ya methilini ilibadilisha katika majaribio haya

Bluu ya methilini ni kibeba elektroni katika miitikio ya redoksi. Umbo lake lililooksidishwa hupokea elektroni kutoka kwenye miitikio ya kikemia inayohusiana na NADH katika kompleksi I, na umbo lake lililoreduksiwa huzitoa kwa sitokromu c, ambayo huzifikisha kwenye kompleksi IV. Hilo huunda njia mbadala ya sehemu ya mnyororo ambapo kwa kawaida elektroni huvuja kwenda kwa oksijeni na kuunda superoksidi. Wasomaji wanaotaka picha kamili ya uhamishaji huo wanapaswa kuanza na jinsi bluu ya methilini inavyohamisha elektroni kupitia mitokondria.

Katika fibroblasti za mapafu zilizowekwa kwenye erastin, bluu ya methilini katika 250 nanomolar ilihifadhi uhai wa seli kulingana na kipimo cha uhai wa seli, pamoja na vioksidishaji-kinzani vinavyolenga mitokondria, SkQ1 na MitoTEMPO. Vidhibiti vinafafanua dai hilo. Ferrostatin-1, alpha-tocopherol, na deferoxamine pia zilitoa ulinzi, jambo linalothibitisha kuwa kifo kilikuwa cha ferroptosisi. Analogi ya SkQ1 isiyo na kikundi cha kikemia kinachozuia oksidesheni haikutoa ulinzi, jambo linaloashiria miitikio ya redoksi badala ya mkusanyiko usio mahususi. Ulinzi ulipungua juu ya takriban 200 nanomolar ya SkQ1, kulingana na tabia inayojulikana ya vioksidishaji-kinzani vya kwinoni ya kuchochea oksidesheni katika viwango vya juu zaidi. Bluu ya methilini ina tabia hiyo hiyo yenye pande mbili kulingana na kiwango: hutoa ulinzi katika viwango vya chini vya nanomolar kwenye vyombo hivi vya ukuzaji wa seli, na inaweza kuzalisha peroksidi ya hidrojeni kupitia mizunguko ya redoksi kiwango kinapoongezwa zaidi au inapoangaziwa kwa mwanga mkali. Muktadha wa kipimo wa aina hii umeelezwa katika aina tendaji za oksijeni katika mitokondria.

Majaribio ya mitokondria iliyotengwa kisha yalitenganisha vyanzo vya ROS. Chuma ferasi kilipokuwapo, substrates zinazolisha kompleksi I pamoja na rotenone zilichochea oksidesheni ya kichunguzi. Rotenone huzuia sehemu iliyo baada ya eneo la flavini katika mnyororo, kwa hiyo vibeba elektroni vilivyo kabla yake hubaki katika hali iliyoreduksiwa na kuvuja elektroni kwenda kwa oksijeni kutoka kwenye flavini inayoelekea upande wa matriksi. Substrates zinazolisha kompleksi III pamoja na antimycin A zilizalisha peroksidi nyingi ya hidrojeni lakini hazikuchochea peroksidesheni ya lipidi. Ishara ya jumla ya ROS ilikuwa sawa, lakini eneo lilikuwa tofauti na matokeo yalikuwa tofauti. SkQ1 na bluu ya methilini kila moja ilikandamiza peroksidesheni iliyochochewa na kompleksi I bila kukandamiza uzalishaji wa peroksidi ya hidrojeni yenyewe, jambo linaloweka hatua yao baada ya uundaji wa ROS, katika hatua ya peroksidesheni ya lipidi.

Sehemu ya utafiti wa chuma kingi kupita kiasi na kidokezo cha lipofusini

Utafiti wa pili uliuliza swali hilo kwa kuanzia upande wa chuma. Seli za misuli ya moyo za H9c2 zilizowekwa kwenye ferric ammonium citrate katika viwango chini ya millimolar zilipata ROS za mitokondria, peroksidesheni ya lipidi za mitokondria, kisha ferroptosisi, ikifuatiwa na mkusanyiko wa rangi inayofanana na lipofusini ndani ya saa 24. Lipofusini ni mabaki ya lipidi na protini zilizooksidishwa, yenye chuma na fluoresensi ya asili, ambayo hujikusanya kadiri umri unavyoongezeka; kuonekana kwake haraka hapa kunahusisha peroksidesheni ya papo hapo inayochochewa na chuma na kiashiria cha kawaida cha kuzeeka. Bluu ya methilini katika viwango vya nanomolar na SkQ1 kila moja ilizuia peroksidesheni, kifo, na mkusanyiko wa rangi. Mitokondria ya moyo iliyotengwa ilithibitisha mfumo huo: rotenone pamoja na chuma ferasi zilichochea peroksidesheni na ishara inayofanana na rangi, na mawakala wote wawili waliizuia. Mfululizo kamili umeripotiwa katika utafiti wa chuma kingi kupita kiasi katika seli za misuli ya moyo za H9c2. Sehemu inayohusu rangi inahusiana na lipofusini na viashiria vya kuzeeka kwa seli.

Kile ambacho vipimo vya uhai wa seli havionyeshi

Kipimo cha uhai kama CellTiterBlue huripoti ni seli ngapi katika chombo cha ukuzaji zinazobaki na shughuli za kimetaboliki baada ya kuwekwa kwenye kichochezi pamoja na dutu inayojaribiwa kama kinga. Huo ni mtihani wa utaratibu katika mfumo uliobainishwa. Si matokeo ya matibabu. Hakuna jaribio lolote kati ya haya lililompa mgonjwa kipimo, kupima matokeo ya ugonjwa, au kubaini kiwango cha matumizi ya matibabu chenye manufaa na usalama ndani ya mwili.

Mipaka minne inahitaji kutajwa wazi. Kwanza, aina za seli ni chache: fibroblasti za mapafu zilizobadilishwa, fibroblasti za msingi za ngozi zikiwemo za mstari mmoja wenye ugonjwa wa mitokondria, na mstari wa seli za misuli ya moyo wa panya, pamoja na mitokondria iliyotengwa kutoka mioyo ya panya. Unyeti ulitofautiana kati ya mistari ya seli, na mstari wa LHON ulikuwa na uwezekano mkubwa usio wa kawaida wa kuathirika, kama ilivyokusudiwa katika muundo wa utafiti. Pili, vichochezi ni hali kali za maabara: kuzuiwa kabisa kwa usafirishaji au utengenezaji, na kiasi cha chuma ambacho hakuna tishu ingekutana nacho kwa muda mfupi. Tatu, ukolezi hauwezi kubadilishwa kuwa kipimo kwa kuzidisha tu. Kiwango cha nanomolar katika kimiminika cha ukuzaji wa seli si kipimo cha binadamu, na usambazaji wa bluu ya methilini, kureduksiwa kwake kuwa umbo lisilo na rangi katika damu na tishu, kuathiriwa na mwanga, na tofauti ya potenshali kwenye utando vyote hutenganisha hali ya chombo cha maabara na ile ya mtu. Nne, vichunguzi huripoti sehemu zao wenyewe. Oksidesheni ya MitoCLox huonyesha kwamba radikali za lipidi za mitokondria ziliundwa; haionyeshi kwamba kupasuka kwa utando wa seli, ambako huenda ndilo tukio la mwisho, kulizuiwa moja kwa moja badala ya kuepukwa kwa kuzuia hatua za awali.

Kwa hiyo dai la uaminifu ni hili: katika modeli hizi, ROS zinazotokana na kompleksi I pamoja na chuma huchochea peroksidesheni ya lipidi za mitokondria inayotangulia ferroptosisi, na bluu ya methilini katika viwango vya chini hukatiza sehemu hiyo. Chochote kinachozidi sehemu hiyo kinahitaji majaribio tofauti kwa wanyama na kisha kwa watu.