Vem utvecklade den lila blodfärgningen? Metylenblått, Malachowski, Romanowsky och Giemsa

Eosin är rött. Metylenblått är blått. Blanda de två, applicera blandningen på ett torkat blodutstryk, och delar av utstryket blir lila.

Inte alla delar. I ett bra preparat blir de vita blodkropparnas kärnor rödlila, och inne i en malariaparasit får kromatinet samma färg, medan de omgivande röda blodkropparna förblir rosa och cytoplasman förblir gråblå. Det är den lila färgen som gör att celltyperna går att skilja åt.

Ingen av flaskorna innehåller lila. Färgen uppstår först när en viss nedbrytningsprodukt av metylenblått möter eosin på objektglaset, och på 1880- och 1890-talen visste ingen att den produkten fanns, än mindre vad den var. De som försökte få fram färgen arbetade ensamma med orena färgämnen, utan något tillförlitligt sätt att ta reda på vad en flaska innehöll efter att den stått på en hylla i två månader.

Därför har frågan i rubriken mer än ett försvarbart svar, och därför förändrades svaret 2011.

Vad man kunde se förändrades med blandningen

Färgningen uppfanns inte. Den växte fram steg för steg. Varje förändring av blandningen gav tillgång till exakt en ny synlig detalj, och dessa detaljers ordningsföljd är det tydligaste sättet att förstå historien.

Mönstret i den sista kolumnen är det viktiga. Varje framsteg breddade färgspektrumet, och varje breddning gjorde ytterligare en struktur synlig. Den lila färgen är inte en utsmyckning av tekniken; den är skillnaden mellan att se att en parasit finns där och att se vad den består av. Hur själva färgämnet tog sig från en av BASF:s färgfabriker till medicinen är en längre historia med egna dokument. Hela förloppet ovan, med källan bakom varje post, finns i en tidslinje över bidragsgivarna med källänkar.

Figur: samma sex blandningar, avbildade som vad skålen innehöll och vad resultatet blev. Cirklarna visar färgämnena; blocken under dem visar de färger som dessa färgämnen kunde ge i ett blodutstryk. Före 1890 finns inget rödlila block, och efter det saknas det aldrig.

Mannen som använde borax avsiktligt

Ernst Malachowski var läkare i Breslau, nuvarande Wrocław, och tillbringade sitt yrkesliv i privatpraktik och på en liten klinik som han drev med en kollega. Laboratoriearbetet utförde han på sin fritid. Han föddes i Strzelno den 12 mars 1857, studerade medicin vid universitetet i Breslau och arbetade från 1882 till 1887 som assistent inom internmedicin på Allhelgonasjukhuset, då Tysklands näst största sjukhus.

Han började 1888 med Chęcińskis och Plehns dubbelfärgning. I ett preparat från 1889 såg han att kromatinet i plasmodiets kärna färgades annorlunda än cytoplasman, men upptäckte sedan att han inte kunde reproducera resultatet. Han försökte göra metylenblåttet surare, vilket försämrade resultatet. Han försökte göra det alkaliskt med borax, vilket fungerade varje gång. Han demonstrerade metoden offentligt den 15 juni 1890 och publicerade en utförligare beskrivning i augusti 1891, inklusive anvisningen om borax. Han noterade att färgningen tog tjugofyra timmar och att resultaten var lätta att reproducera.

Tjugofyra timmar är lång tid i ett diagnostiskt laboratorium, och hans artikel uppehöll sig inte vid parasitkärnans lilaröda färg. Oavsett orsaken tog ingen upp avsiktlig alkalisering av metylenblått förrän Nocht gjorde det igen 1898. Malachowski skrev aldrig mer om blodfärgning.

Att så lite var känt om honom fram till nyligen beror på arkivläget snarare än på något mysterium. Nästan inga spår av hans liv överlevde i den medicinska litteraturen, och det som bevarades kom via en enda väg. Hans dotter Marie lämnade Tyskland för London 1939, tjänstgjorde i den brittiska armén och bosatte sig i Kanada, och hennes samling av familjehandlingar hamnade på Leo Baeck Institute i New York. Hennes bror Leo dödades i första världskriget. Hennes syster Eva deporterades från Breslau till transitlägret Izbica i april 1942 och återvände aldrig. Hennes mor Hedwig tog sitt liv den 22 april 1942 i stället för att invänta samma deportation. Malachowski hade dött 1934, innan något av detta hände.

En familjehistoria som slutar så är en familjehistoria som slutar citeras. De två artiklar som återgav Malachowski hans plats i färgningens utveckling, båda publicerade 2011, sammanställdes utifrån arkivhandlingar i Poznań och Wrocław och Maries handlingar i New York.

En möglig flaska och en tursam ryss

Dmitri Romanowsky studerade medicin vid Militärmedicinska akademin i Sankt Petersburg och arbetade med malaria under större delen av sitt yrkesliv. År 1890 publicerade han en metod som på papperet var nästan identisk med Chęcińskis: oförändrat metylenblått och eosin, med lite mer eosin.

I september 1891 publicerade han metoden som gjorde honom känd, och den avgörande detaljen var undangömd i anvisningarna. Hans bästa resultat kom från die vorräthige Methylenlösung, en stamlösning av metylenblått som hade stått i över två månader med mögel på ytan. Möglet och lagringstiden hade delvis demetylerat färgämnet. Romanowsky visste inte detta och kunde inte kontrollera det, och andra som provade hans metod kunde inte få fram den lila färgen. Hans avhandling hade lämnats in i Sankt Petersburg i juni 1891, vilket är anledningen till att den vedertagna historieskrivningen anger 1891 som upptäcktsåret.

Malachowskis demonstration hade ägt rum i juni 1890, mer än ett år tidigare, och hans metod fungerade avsiktligt.

Varför färgningen fick fel mans namn

Argumenten för Malachowski sammanställdes av Kristine Krafts, Ernst Hempelmann och Barbara Oleksyn och vilar på fyra saker. Datumet för den offentliga demonstrationen, juni 1890 mot september 1891. Ordet avsiktlig mot ordet slumpmässig. Att Malachowski publicerade sin metod, inklusive borax, medan Romanowskys metod var beroende av en okontrollerad variabel. Och iakttagelsen att beskrivningen av plasmodiets kärna, tillsammans med den lila färg som synliggjorde den, i praktiken försvann ur litteraturen i sju år eftersom ingen kunde reproducera den slumpmässiga varianten.

De uttrycker sin slutsats utan omsvep. I den biografiska artikeln kallar de tillskrivningen ”en parodi”, och de citerar Ralph Lillie, som 1978 skrev att ”vi kanske borde kalla denna grupp av färgningar för Malachowski-färgningar”.

Anspråket är omstritt, som prioritetsanspråk brukar vara, och konfliktens utformning är värd att förklara snarare än att avgöra. Ett resonemang om prioritet måste ange vad upptäckten bestod i. Om upptäckten är den lila färgen har Malachowski den tidigare dokumenterade demonstrationen. Om upptäckten är den publicerade metoden publicerade båda männen 1891, och färgningen fick Romanowskys namn. Om upptäckten är förklaringen kan ingen av dem göra anspråk på den, eftersom ingen visste att mognaden var demetylering och ingen kunde säga varför färgen alls uppstod. Det sista är den punkt som populära skildringar hoppar över. Den verksamma beståndsdelen var en förorening som ingen hade identifierat, och den första personen som framställde färgen avsiktligt gjorde det med ett reproducerbart empiriskt recept, inte utifrån en förståelse av vad receptet gjorde.

De två artiklarna från 2011 är den mest utförliga publicerade framställningen av argumenten för Malachowski, och båda går att läsa gratis via PubMed: den långa översiktsartikeln på PMID 21235291 och den biografiska artikeln på PMID 21660627. PubMed-posten för översiktsartikeln listar också en kommentar till den, publicerad i samma tidskrift senare samma år på 86(5):366, vilket är en rimlig påminnelse om att resonemanget ifrågasattes i tryck så snart det publicerades.

Tvisten handlar däremot inte om oenighet kring kemin. Alla inblandade är överens om vad den lila färgen är och vilka beståndsdelar som ger upphov till den. Oenigheten gäller vem som kom dit först och om en slump som ingen kunde upprepa alls räknas som att ha kommit dit.

Vad de senare namnen tillförde

Om Malachowski framställde den lila färgen först, varför bär färgningen då Romanowskys, Wrights och Giemsas namn?

Därför att en färgblandning som fungerar en gång i uppfinnarens händer inte är ett reagens. Det senare arbetet förvandlade en nyckfull blandning till något som en laboratorietekniker i ett annat land kunde använda en helt vanlig tisdag.

Nocht nådde dit genom resonemang. Efter att ha misslyckats med att få ett tillförlitligt resultat med ett enkelt neutralt färgämne drog han slutsatsen att den lila färgen måste komma från något i metylenblåttet som inte var metylenblått, och började leta efter det. Unna hade redan lagt märke till att åldrade metylenblåttlösningar färgade mastcellernas granula röda och föreslagit att ett nytt ämne bildades när färgämnet mognade. Bernthsen hade 1885 visat att alkaliska förhållanden avlägsnar metylgrupper från metylenblått och att dessa produkter är vad vi nu kallar azurfärgämnen. Nocht extraherade den aktiva fraktionen med kloroform och kunde bara kalla den Rot aus Methylenblau, rött från metylenblått; Michaelis gav den namnet azure I 1901. Jenner löste logistiken. Genom att åter lösa upp fällningen av metylenblått och eosin i absolut metanol fick man en enda stabil lösning som fixerade utstryket samtidigt som den färgade det och gjorde värmefixering överflödig. Leishman och Reuter kombinerade polykromt färgämne med ett alkoholbaserat lösningsmedel och fick både stabilitet och den lila färgen. Wright ersatte en tolv timmar lång inkubation vid 65 °C och tio dagars lagring med en timme i strömmande ånga. Giemsa slutade helt att förlita sig på en slumpmässigt mognad lösning och använde uppmätta mängder av kända färgämnen med glycerol i metanolen, så att produkten tålde tropisk värme. Han publicerade aldrig hur han framställde rent metylenazur. Han sålde det till Dr Grüblers laboratorium i Leipzig, som marknadsförde det som azure I och hävdade att bara deras variant var äkta Giemsa-färgning.

Vilket ämne detta azurfärgämne egentligen var diskuteras fortfarande. Vissa menar att det helt enkelt var polykromt metylenblått, andra att det var rikt på Azure B. Svaret kom ur ett krig. När tyska färgämnen inte längre gick att få tag på upptäckte en grupp vid United States Public Health Service, Ralph Lillie tillsammans med Maurice Roe och Aimee Wilcox, att den bästa färgningen kom från tre separerade beståndsdelar: oförändrat metylenblått, dess demetylerade nedbrytningsprodukt Azure B och eosin. Azure B ersatte det otillgängliga azure I, och dessa tre beståndsdelar utgör fortfarande grunden för den färgning som används för att diagnostisera malaria i dag.

Kemin bakom hur dessa tre beståndsdelar samverkar på ett objektglas är en separat fråga som behandlas på en annan sida. Färgämnenas roller och kemin bakom färgningar av Romanowsky-typ beskriver vad Azure B och eosin gör var för sig och varför kombinationen ger en färg som inget av dem ger ensamt. Sidan om mikroskopi och laboratorietillämpningar behandlar den praktiska sidan: vad ett visst preparat visar och hur man bedömer om en viss produkt är lämplig för den metod man tänker använda.

Den del av historien som fortfarande är aktuell

En detalj i den här historien upphörde inte att gälla 1902. Under ungefär femtio år var den viktigaste beståndsdelen i världens standardfärgning för malaria en namnlös förorening. Den fanns där av en slump, mängden varierade mellan flaskorna, dess identitet var under en del av tiden en affärshemlighet och dess andel diskuterades ända in på 1940-talet. De som använde färgningen var inte vårdslösa. De hade inget sätt att veta vad flaskan innehöll.

Den moderna versionen av samma problem är en specifikation som bara beskriver en del av materialet. Överensstämmelse med USP är vägen till den högsta renhet som marknaden erbjuder, eftersom det är en fullständig publicerad standard snarare än en enskild mätning: identitet, renhet, organiska föroreningar inklusive azurfärgämnena, kvarvarande lösningsmedel, elementföroreningar, glödgningsrest, mikrobiella gränsvärden och bakteriella endotoxiner. Blupreme köper sitt metylenblått från en läkemedelstillverkare och publicerar det fullständiga analyscertifikatet, så att varje punkt på listan kan kontrolleras i stället för att bara påstås vara uppfylld. Ett certifikat som redovisar ett resultat för tungmetaller och kallar det överensstämmelse med USP är dagens motsvarighet till en flaska märkt ”mognat metylenblått”: möjligen ett utmärkt reagens, men etiketten talar inte om vad det innehåller.