Metylenblått för DNA- och RNA-färgning: tillämpningar i geler och på membran

En student kör en agarosgel, färgar den med metylenblått och ser ingenting där ett tydligt band förväntades. Vid nästa arbetsplats färgar en postdoktor ett Northern-membran med samma blå flaska och får skarpa ribosomala band på tre minuter. Studenten drar slutsatsen att gelkörningen misslyckades. Det gjorde den inte. Uppgifterna var olika, och samma färgämne besvarar dem med olika känslighet, olika bakgrund och olika regler för nästa steg.

DNA-färgning och RNA-färgning med metylenblått bygger på samma kemi men har olika syften. I en gel visar färgämnet hur mycket nukleinsyra som finns i en porös matris. På ett membran visar det om överföringen fungerade och om lika mycket prov laddades i de olika banorna. När den skillnaden är tydlig blir protokollen, detektionsgränserna och kompatibilitetsgränserna lättare att förstå.

Det korta svaret

Metylenblått är ett plant katjoniskt färgämne som binder till nukleinsyror icke-kovalent och reversibelt genom en kombination av elektrostatisk attraktion till fosfat, interkalering mellan baspar och association med den lilla fåran. Reversibiliteten är själva poängen. Band kan färgas och avläsas i synligt ljus, dokumenteras och sedan avfärgas eller renas inför kloning, hybridisering eller omprobning.

För färgning av dubbelsträngat DNA i agarosgel med metylenblått är det vanliga snabbprotokollet 0.02 procent w/v (200 mikrogram per mL) i vatten, ungefär 15 minuters färgning följt av ungefär 15 minuters avfärgning i vatten, med avläsning på ett ljusbord med vitt ljus. För membran använder det klassiska Northern blot-protokollet 0.02 till 0.04 procent färgämne i natriumacetat nära pH 5.2, flera minuters färgning efter överföring och immobilisering, följt av sköljning i vatten och fullständig avfärgning före hybridisering. Känsligheten är måttlig: tiotals till hundratals nanogram per gelband under goda förhållanden, medan försiktiga riktvärden anger 0.5 till 1 mikrogram. Det är flera storleksordningar över gränserna för etidiumbromid och SYBR-färgämnen. På membran finns ingen användbar enskild detektionsgräns för transkript, eftersom färgningen främst visar rikligt förekommande ribosomalt RNA och den totala mängden laddat material. Ersätt inte färgämnet med en lösning som säljs som kosttillskott i något av protokollen. Validerade metoder förutsätter färgämne av analyskvalitet, definierade buffertar och RNas-fri hantering när RNA ingår.

Hur bindningen fungerar och när den kan vilseleda

Den användbara modellen har tre delar. För det första attraheras det positivt laddade ringsystemet av den negativt laddade fosfatryggraden. Spektroskopiska studier visar att denna elektrostatiska komponent dominerar vid låg salthalt, medan modellering och molekyldynamik identifierar interkalering och bindning i den lilla fåran som stabila bindningssätt för dubbelsträngat DNA, vilket sammanfattas i en spektroskopisk studie av metylenblåtts bindning till DNA. För det andra finns en viss GC-preferens: modellering gynnar CpG- och GpC-steg, och experiment visar företrädesvis association med GC-rika duplexer i studier av metylenblåtts interkaleringspreferenser, men även AT-duplexer binder färgämnet. Rutinmässig färgning är inte sekvensspecifik. För det tredje binder enkelsträngat DNA och RNA främst genom elektrostatiska interaktioner och staplingsinteraktioner med tillgängliga baser och duplexregioner. Därför varierar färgningsintensiteten med längd, sekvens och sekundärstruktur.

Detta får två konsekvenser. Eftersom bindningen är icke-kovalent kan färgämnet tvättas bort. Band i polyakrylamid bleknar snabbt om de inte fixeras avsiktligt, och en särskild variant för permanent fixering finns just därför att vanlig färgning är tillfällig, vilket beskrivs av Soto och Draper för PAGE-geler. Eftersom färgämnet är en fotosensibilisator kan långvarig, stark belysning av färgat DNA i närvaro av syre oxidera guanin och så småningom orsaka enkelsträngsbrott, en mekanism som beskrivs i studier av guan oxidation sensibiliserad av metylenblått. Kort avläsning i vitt ljus undviker de välkända UV-skadorna i klassiska arbetsflöden med etidiumbromid, och den fördelen är relevant vid preparativ utvinning. Synligt ljus är skonsammare, inte ofarligt. Håll belysningstiden kort när DNA:t ska klonas. För mer om fotokemin bakom denna försiktighetsåtgärd, se de två reaktionsvägarna i metylenblåtts fotokemi. För redoxparet och laddningstillstånden som förklarar varför den oxiderade formen binder men den reducerade inte gör det, se kemin bakom metylenblåtts struktur och egenskaper.

Uppgift ett: färgning i geler

Gelfärgning besvarar en fråga: finns det tillräckligt med nukleinsyra i detta band för att det ska synas med blotta ögat? Dubbelsträngat DNA i agaros är det bäst karakteriserade fallet. Den ursprungliga metoden för gelfärgning med metylenblått av Flores och kollegor validerade snabbprotokollet med 0.02 procent på 1 procent agaros och visade att efterföljande utvinning och kloning fungerade. Samma leverantörsprotokoll finns på IBI Scientifics produktsida för metylenblått, där membranprotokollet med 0.04 procent och snabbvarianten för geler anges sida vid sida.

Praktiskt arbetsflöde:

1. Kör gelen som vanligt. Färga efter elektroforesen, inte under den, om inte överföring eller upplösning har validerats för en modifierad metod.
2. Sänk ned gelen i 0.02 procent w/v metylenblått i destillerat vatten under försiktig omrörning i ungefär 15 minuter.
3. Avfärga med flera vattenbyten, ungefär 15 minuter totalt, tills bakgrunden i matrisen minskar och banden framträder.
4. Fotografera omgående på ett ljusbord med vitt ljus.

Agaros och polyakrylamid beter sig olika. Agarosen håller kvar färgämne i matrisen, så avfärgningen är det långsamma steget. Tunna polyakrylamidgeler färgas snabbt men förlorar också färgämnet snabbt, vilket underlättar preparativ utskärning men försvårar arkivering. Syntetiska oligonukleotider i polyakrylamid kan lokaliseras med samma protokoll med 0.02 procent på 20 till 30 minuter med upprepade vattentvättar, enligt etablerade PAGE-metoder av den typ som beskrivs i Current Protocols. Mycket utspädda varianter nära 0.0002 procent i utspädd TBE har rapporterats för preparativa oligonukleotider under flera timmar, men evidensunderlaget är svagare.

Skillnaden mellan DNA och RNA spelar roll. Dubbelsträngat DNA ger den starkaste strukturerade bindningen. RNA och enkelsträngat DNA färgas, men svagare och mindre förutsägbart. För RNA-geler med formaldehyd och agaros hoppar de flesta laboratorier över blåfärgning i gelen och överför först RNA:t till ett membran, där det sedan färgas. Det byter en svag gelsignal mot en skarpare membransignal och ger samtidigt dokumentation av provladdningen.

Uppgift två: färgning på membran

Membranfärgning besvarar en annan fråga: fungerade överföringen, och är banorna jämförbara? Den klassiska tillämpningen är Herrin och Schmidts reversibla Northern blot-färgning, ursprungligen med 0.04 procent färgämne i 50 mM natriumacetat vid pH 5.0 i 2 till 3 minuter följt av sköljning i vatten. Färgämnet kan avlägsnas med utspädd SDS i SSPE före hybridisering.

Den moderna variant som används allmänt går till så här:

1. Överför RNA eller denaturerat DNA till nylon eller nitrocellulosa och immobilisera sedan genom UV-korsbindning eller uppvärmning, så att provet inte går förlorat under färgningen.
2. Valfritt men vanligt: blöt membranet i 5 procent ättiksyra i ungefär 15 minuter.
3. Färga i 5 till 10 minuter i 0.02 till 0.04 procent metylenblått i 0.3 till 0.5 M natriumacetat nära pH 5.2.
4. Skölj och avfärga i vatten i 5 till 15 minuter, dokumentera och avlägsna sedan kvarvarande färgämne före hybridisering.

Positivt laddat nylon dominerar vid Northern blot. Nitrocellulosa fungerar också med samma arbetsflöde med ättiksyra och acetat. Bilden används för att bekräfta överföringen, jämföra 28S- och 18S-band (eller 23S och 16S för bakteriellt RNA), markera storleksmarkörer och standarder samt dokumentera en grov normalisering mot total-RNA. Publicerade Northern-metoder kvantifierar färgade ribosomala band för att kontrollera provladdningen, bland annat inom mejeriforskning där ribosomala band färgade med metylenblått användes för normalisering. Southern-membran kan visualiseras på samma sätt, men färgämnet är betydligt mer etablerat för kontroll av provladdning och överföring vid Northern blot. DNA för Southern blot denatureras dessutom före överföringen, så känslighetsvärden från geler kan inte överföras direkt.

Detektionsgränser och bakgrund: där blått kommer till korta

Jämförelsen nedan är avsiktligt ungefärlig. Färgningens prestanda beror på gelprocent, bandbredd, optik och hur noggrant avfärgningen utförs. Betrakta varje siffra som en storleksordning, inte som en specifikation.

Bakgrundskontrollen avgör om den måttliga signalen går att använda. Fritt färgämne är intensivt färgat, så kontrasten uppstår när obundet färgämne avlägsnas utan att bundet färgämne tas bort. Mer koncentrerad färglösning ökar sällan känsligheten. Den förlänger främst avfärgningstiden. Kör en spädningsserie med exakt den gel, det membran och den kamera som ska användas, och använd endast det intervall där den integrerade densiteten förblir proportionell mot den tillförda mängden. Metylenblått kan användas för semikvantitativ normalisering av provladdning. Det är inte en kvantitativ analys med stort dynamiskt omfång, eftersom membrankapacitet, överföringseffektivitet, mättnad och avfärgning varierar mellan banorna.

Kompatibilitetsgränser: vad klarar färgningen?

Kloning efter blåfärgning har demonstrerats. Flores och kollegor skar ut färgade agarosband, utvann DNA:t och utförde ligering och transformation. De rapporterade bättre kloningsresultat än efter etidiumbromidfärgning med UV. Den sannolika orsaken är mindre ljusskador, inte någon gynnsam effekt av färgämnet i sig. Håll exponeringen för vitt ljus kort och rena det utvunna DNA:t med en vanlig metod för gelextraktion.

Evidensen för PCR och sekvensering är svagare. Kvarvarande färgämne binder till nukleinsyror, så avfärga och rena före enzymatiska steg. Korrekt renat DNA från en blåfärgad gel förväntas fungera, men toleransen för färgämnesrester är inte väl kvantifierad för olika polymeraser och sekvenseringskemier. Utgå inte från att rester tolereras.

Blothybridisering är kompatibel när ordningen följs strikt: överför, immobilisera, färga, dokumentera, avfärga, hybridisera. Den sekvensen är grunden för Herrin och Schmidts metod. Färgning före överföring eller utelämnad avfärgning innebär en annan metod som behöver valideras separat. Efter att färgämnet avlägsnats kan standardmässig borttagning av prober och omprobning utföras som vanligt. För färgning på cellnivå med samma färgämnesfamilj och varför principerna för fixerade utstryk inte kan överföras till metoder för levande celler, se färgningsatlasen för mikroskopi.

Utskärning av band fungerar för preparativ agaros och för PAGE-oligonukleotider som lokaliserats med blåfärgning, förutsatt att varianten med permanent fixering undviks. Elektroeluering efter avfärgning är kemiskt rimlig för ett reversibelt bindande färgämne, men kontrollerade utbytesdata specifikt för metylenblått är få. Avsalta eller fäll ut efter eluering.

Återkommande problem

Svaga gelband betyder vanligtvis att massan är för liten för en kolorimetrisk färgning, särskilt för korta enkelsträngade målmolekyler eller RNA. Ladda mer, använd färsk färglösning, förläng färgningen innan koncentrationen höjs och avsluta avfärgningen tidigare. En helt blå gel utan kontrast betyder vanligtvis överfärgning eller för få vattenbyten. Bleknande PAGE-band är förväntad kemi, inte en misslyckad färgning. Fotografera snabbt. Ojämn membranbakgrund tyder på veck, bubblor, fingeravtryck, ojämn omrörning eller fläckvis överföring. Tolka inte detta som ojämn provladdning utan en hybridiseringskontroll. Ett utsmetat, svagt ribosomalt mönster kan betyda nedbrytning, men också ofullständig överföring, för lite total-RNA (typiska banor innehåller flera till tiotals mikrogram) eller alltför omfattande avfärgning. Färgämnet visar rikligt förekommande ribosomalt RNA. Det visar inte ett specifikt transkript. Den uppgiften tillhör proben.

Säkerhet och hantering utan överdrifter

Metylenblått är enklare att hantera än etidiumbromid, men det är inte ofarligt. Ett aktuellt säkerhetsdatablad från MilliporeSigma klassificerar färgämnet som akut oralt toxiskt i kategori 4, skadligt vid förtäring, och anger omhändertagande via en godkänd avfallshanteringsväg enligt Sigma-Aldrichs säkerhetsdatablad för metylenblått. Etidiumbromid har starkare varningar för genotoxicitet, däribland misstänkta effekter på könsceller i Sigma-Aldrichs säkerhetsdatablad för etidiumbromid. Dess geler och lösningar samlas vanligen separat som farligt kemiskt avfall, vilket anges i Thermo Fishers guide till nukleinsyrafärgämnen. Följ säkerhetsdatabladen och institutionens regler för båda. Förvara torrt färgämne torrt och väl tillslutet, återanvänd arbetslösningen endast enligt protokollet, förvara färgade membran torra mellan filterpappersark och fotografera geler innan banden diffunderar bort.

Kom ihåg sammanfattningen för laboratoriebänken. Geler testar synlighet vid hög provmängd i vitt ljus. Membran testar överföring och provladdning innan proben gör det känsliga arbetet. Ett färgämne fungerar för båda, med måttlig känslighet, reversibel bindning och strikt ordningsföljd.