Metylenblått och ALS: varför resultaten skiljer sig mellan experimentella modeller

Sök på metylenblått och ALS så hittar du två påståenden som verkar motsäga varandra. Det ena säger att det blå färgämnet skyddade nervceller i ALS-modeller. Det andra säger att det inte hade någon effekt i en ALS-musmodell. Båda påståendena hänvisar till verkliga vetenskapliga artiklar, och båda artiklarna är värda att ta på allvar. Motsägelsen försvinner när man tydliggör grundtanken bakom varje experiment: modellen avgör vad man kan hävda.

Ett resultat hos en mask säger något om en mask. Ett resultat hos en fisklarv säger något om en fisklarv. Inget av dem säger något om en patient förrän ett sjukdomsförlopp hos ett däggdjur ger stöd för det. Den här artikeln jämför de två mest citerade artiklarna sida vid sida så att du kan se varför de ger olika svar.

De två experimenten i en tabell

Ha den här tabellen till hands medan du läser. Alla viktiga skillnader mellan studierna ryms i den.

Genetiken skiljer sig, arterna skiljer sig, administreringsvägen skiljer sig, tidpunkterna skiljer sig och utfallsmåtten skiljer sig. Genotypen är bara en av fem skillnader, så de två studierna kan inte bevisa att metylenblått verkar selektivt på en viss ALS-relaterad mekanism. De visar något mer begränsat men fortfarande användbart: en kraftig förbättring vid tidig direkt exponering i enkla modeller överfördes inte till ett sjukdomsförlopp hos däggdjur med långvarig oral behandling.

Det positiva resultatet: vad studien på maskar och fiskar visade

I studien på maskar och fiskar från 2012 uttrycktes muterat humant TDP-43 eller FUS i maskarnas motorneuron, och muterat humant mRNA injicerades i fiskembryon. Det här är modeller för proteotoxicitet. De återskapar det muterade proteinets toxiska effekter på rörelseförmåga och nervcellernas form under några dagar, inte hela förloppet av ALS hos vuxna människor över flera år.

Behandlingen började mycket tidigt. Maskarna växte på agar som innehöll metylenblått från kläckningen. Fiskembryona låg i läkemedelslösning över natten med start 24 timmar efter befruktningen, och beteendet testades omkring två dagar senare. Ingen blod–hjärnbarriär stod mellan läkemedlet och nervcellen på samma sätt som hos ett däggdjur, och inga läkemedelsnivåer i plasma eller hjärna mättes.

Under dessa förhållanden var effekterna stora och samstämmiga. Både 6 och 60 μM minskade åldersberoende förlamning hos maskar med TDP-43 och FUS. På vuxendag 12 var ungefär 80 procent av de obehandlade maskarna med TDP-43 förlamade, jämfört med cirka 10 procent av maskarna som behandlats från kläckningen. Ett synaptiskt test pekade i samma riktning: maskar med TDP-43 var överkänsliga mot aldikarb, ett läkemedel som används för att undersöka neuromuskulär signalöverföring, och metylenblått försköt svaret tillbaka mot det normala. Antalet degenererande motorneuronutskott minskade, med tydligast effekt vid 60 μM. Hos fiskarna förbättrades simningen som utlöstes av beröring avsevärt, och förkortade motoraxon växte tillbaka mot normal längd vid 30 eller 60 μM, även om återhämtningen var partiell snarare än fullständig.

Data om oxidativ stress är förenliga med en antioxidantförklaring. Muterade maskar och fiskar uppvisade förhöjda mätvärden för reaktiva syreföreningar som sjönk med behandlingen, och normala maskar som fick metylenblått överlevde en prooxidativ belastning betydligt längre än obehandlade maskar. Men två begränsningar är viktiga. De totala nivåerna av muterat TDP-43- och FUS-protein sjönk inte, och studien kvantifierade inte proteinaggregat direkt. Den visar därför en förbättrad funktion utan att bevisa att aggregat avlägsnades. Den som följer hur redox- och mitokondriehypoteser vanligtvis formuleras bör se mekanismen som underbyggd men inte fastställd.

Tidpunkten var den mest lärorika detaljen. När författarna väntade till vuxendag 5 med att börja behandlingen var förlamningsfrekvensen på dag 12 cirka 55 procent, i stället för cirka 10 procent vid behandling från kläckningen. Samma läkemedel, samma mask, samma mutation, mycket mindre effekt. Tidig förebyggande exponering stod för en stor del av den observerade nyttan.

Nollresultatet: vad studien på SOD1-möss visade

Musstudien från 2011 ställde en svårare fråga i ett striktare system. Kongena SOD1 G93A-möss utvecklas från skakningar i bakbenen via gångsvårigheter och förlust av rätningsreflexen till en fördefinierad terminal slutpunkt. Behandlingen började före symtomen på dag 45 och fortsatte dagligen, medan observatörer bedömde neurologiska symtom på en skala från 0 till 6. Det här är ett experiment som omfattar hela sjukdomsförloppet, vilket gör det närmare det som en patient skulle bry sig om än någon förlamningskurva hos en mask.

Huvudresultaten visade ingen effekt. Den övergripande symtomdebuten inträffade vid 121 dagar hos kontrollerna jämfört med 124 dagar med metylenblått, en skillnad som inte var signifikant. Överlevnaden till slutstadiet var 167 dagar jämfört med 170 dagar, inte heller en signifikant skillnad. Några sekundära delanalyser talade till behandlingens fördel: honorna hade en fördröjd symtomdebut på cirka 7 dagar, och behandlade djur tillbringade något mer tid i lindrigare stadier och mindre tid i svåra stadier. Med små könsuppdelade undergrupper och många jämförelser mellan stadier bör dessa delresultat ses som hypotesgenererande snarare än som bevis. Varken nervcellsantal, SOD1-aggregering eller oxidativa eller inflammatoriska markörer mättes. Studien kan därför inte heller säga om läkemedlet nådde sina mål och misslyckades eller helt enkelt aldrig påverkade dem vid denna dos. Endast en dos testades.

Författarna själva lyfte fram den mest grundläggande begränsningen, som gäller i båda riktningarna. SOD1 G93A med högt kopietal modellerar toxisk SOD1-sjukdom väl, men SOD1-sjukdom utgör en liten del av familjär ALS och har en annan biologi än de flesta sporadiska fall. De föreslog att kandidater skulle testas på nytt i TDP-43-baserade däggdjursmodeller. Det förslaget har sedan dess blivit mer komplicerat, eftersom författarna till studien på maskar och fiskar påpekar att en separat studie av metylenblått på TDP-43-möss inte heller förbättrade motoriska utfall. En substans kan alltså visa en stark effekt i ett TDP-43-system och ingen effekt i ett annat TDP-43-system. Systemet spelar lika stor roll som genen.

Varför förbättring hos en mask eller fisk inte kan fastställa nytta för patienter

Se varje modell som ett svar på en annan fråga.

För det första skiljer sig biologin. TDP-43 och FUS är nukleinsyrabindande proteiner med gemensamma genetiska interaktioner i dessa enkla system, medan SOD1-toxicitet verkar genom delvis andra närliggande mekanismer. Ett läkemedel som lindrar en typ av proteotoxisk stress behöver inte lindra en annan, och framgång mot överuttryck hos embryon behöver inte förutsäga framgång mot långsam neurodegeneration hos vuxna med inflammation, gliacellers medverkan och systemisk försämring.

För det andra skiljer sig exponeringen. Kontinuerlig exponering i ett medium med mikromolära koncentrationer är inte oral dosering. Tarmabsorption, förstapassagemetabolism, bindning till plasmaproteiner, passage till hjärnan och clearance ligger alla mellan en nedsvald dos och ett motorneuron i ryggmärgen. Ingen av studierna mätte läkemedelsnivåer i nervsystemet, så ingen av dem kan koppla sin koncentration till den andras.

För det tredje skiljer sig tidpunkterna. Fördelarna hos maskarna och fiskarna var starkt beroende av behandling innan patologiska förändringar hade ansamlats. Även musbehandlingen började före symtomdebut, vilket är en styrka, men behandling av människor skulle nästan alltid börja efter symtomdebut, alltså ännu senare. En förebyggande effektsignal i ett två dagar långt embryotest är en utgångspunkt för forskning, inte en modell för klinisk användning.

För det fjärde skiljer sig utfallsmåtten. Förlamning vid 12 dagar, känslighet för aldikarb, axonlängd i mikrometer och simsträcka är proximala fenotyper. Symtomdebut och överlevnad hos ett däggdjur sammanväger alla kompenserande och komplicerande processer i kroppen. Läkemedel påverkar ofta proximala mätvärden utan att påverka överlevnaden, vilket är skälet till att utfallsmått för tid till händelse hos däggdjur används.

Läsare som vill ha en checklista inför nästa rubrik kan hämta en från hur man läser prekliniska studier: fråga vilken art och transgen som användes, vilken dos och administreringsväg som valdes, om läkemedelsnivåer mättes, när behandlingen började i förhållande till patologin, om utfallsmåttet var en kortsiktig fenotyp eller ett sjukdomsförlopp och om effekten upprepades i ett andra laboratorium. Det bredare kunskapsunderlaget om metylenblått hos människor är fortfarande det man bör granska för att se om några av dessa tidiga signaler utvecklades till kliniska data.

Vad detta betyder för patienter och familjer

Dessa artiklar ger inget etablerat behandlingsprotokoll med metylenblått för ALS. Den positiva studien stöder fortsatt forskning om oxidativa och synaptiska mekanismer i TDP-43- och FUS-biologi. Studien med nollresultat talar emot att förvänta sig en påverkan på sjukdomsförloppet vid långvarig oral dosering med denna exponering i sjukdom av SOD1-typ. Tillsammans beskriver de bristande samstämmighet mellan modeller, inte en behandlingsrekommendation.

Säkerhet förtjänar samma nyktra bedömning som effekt. ALS-studier på möss säger inget om säker dosering hos människor, och metylenblått medför verkliga risker genom hemolys vid G6PD-brist och genom serotonintoxicitet i kombination med serotonerga läkemedel. Misstänkt G6PD-brist, pågående användning av antidepressiva läkemedel och eventuella planerade läkemedelsändringar hör hemma i ett samtal med läkare, liksom en genomgång av allmänna säkerhetsdata för metylenblått innan någon agerar på rubriker om laboratorieresultat.

Slutsatsen ryms i en mening. Metylenblått gav kraftiga förbättringar av TDP-43- och FUS-relaterade fenotyper hos maskar och fisklarver vid tidig exponering, men i stort sett ingen fördel vad gäller symtomdebut eller överlevnad i en SOD1-musstudie med långvarig oral behandling. Den ärliga tolkningen är därför modellberoende evidens som inte stöder användning hos patienter.