Avläsning av E. coli och andra koloniutseenden på EMB-agar

En student stryker ut ett okänt prov på eosin-metylenblått-agar, inkuberar det över natten och återvänder till en platta med mörka kolonier med ett grönt skimmer. Anteckningen i laboratoriejournalen lyder ”E. coli, bekräftad”. Den anteckningen hävdar mer än plattan kan belägga. Plattan visar en tillväxt- och fermentationsfenotyp under specifika förhållanden. Artidentiteten är ett separat påstående som kräver separata belägg.

Den här guiden behandlar resultat på EMB-agar som en tolkningsuppgift. Den förklarar den bakomliggande principen, går igenom en illustrativ plattatlas med kontroller och beskriver de fall där läroboksbilden är missvisande.

Principen bakom plattan

EMB-agar är både selektiv och differentiell. Färgämnena eosin Y och metylenblått hämmar många grampositiva organismer, så mediet gynnar gramnegativ tillväxt. Samma färgämnen fungerar som indikatorer: när en organism fermenterar det tillgängliga sockret och producerar tillräckligt mycket syra lokalt tar kolonin upp mycket färgämne och blir mörklila till blåsvart. Vid kraftig syraproduktion kan koloniytan visa en metalliskt grön irisering. ASM:s protokoll för eosin-metylenblått-agarplattor beskriver denna kombination av selektion och differentiering och innehåller referensfotografier för undervisning.

En detalj är viktig innan något resultat avläses: kontrollera vilken formulering som används. Den äldre Holt Harris Teague-formuleringen innehåller laktos och sackaros, medan Levine EMB endast innehåller laktos. En organism som fermenterar sackaros men inte laktos, till exempel många isolat av Serratia marcescens, kan se olika ut på de två varianterna. Tillverkarens dokumentation för EMB-medier anger uttryckligen denna skillnad i formulering. Anteckna tillverkare och formulering i laboratoriejournalen tillsammans med resultatet.

Färdigberedd, oinokulerad EMB-agar är vanligen rödbrun till rödlila, ibland med en grönaktig ton eller fin utfällning. Den bakgrundsfärgen är inte tillväxt. Jämför varje avläsning med en oinokulerad platta eller det dokumenterade utgångsutseendet, och avläs primärplattan efter ungefär 18 till 24 timmars aerob inkubation vid 35 till 37 C om undervisningsprotokollet inte anger något annat. Förlängd inkubation kan förändra hur fermentationsreaktionen ser ut.

Så granskar du plattan

Använd två typer av ljus. Inspektera först plattan i reflekterat eller snett infallande ljus och luta den: metallglansen är iriserande och kan framträda eller försvinna beroende på betraktningsvinkeln. Undersök den sedan i genomfallande ljus för att bedöma kolonifärg och mörka centra. Utgå från väl isolerade kolonier, eftersom tät tillväxt och närliggande kolonier förändrar den lokala ansamlingen av syra och kan försvaga eller förstärka färgen. ASM:s bildsamling visar detta direkt: E. coli i blandkultur kan förlora sin förväntade glans eftersom omgivande organismer förändrar den lokala syramiljön.

Ta med kontroller när övningen tillåter det. En vanlig uppsättning för undervisning är E. coli ATCC 25922 för den blåsvarta fenotypen med metallglans, en icke-fermenterande organism såsom Salmonella Typhimurium ATCC 14028 eller Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 för den färglösa fenotypen, och en grampositiv organism såsom Enterococcus faecalis eller Staphylococcus aureus som hämningskontroll, enligt standardtabeller för kvalitetskontroll av EMB-medier. Om den positiva kontrollen saknar glans bör du först misstänka inkubation, tät tillväxt eller formulering, innan du misstänker det okända provet.

Illustrativ plattatlas

Plattorna nedan är genererade illustrationer, inte fotografier av verkliga kulturer. De visar mönstret att leta efter, inte den exakta nyansen hos en enskild stam. Jämför dem med ASM:s referensfotografier och med verkliga plattor från undervisningslaboratoriet.

Platta 1: Escherichia coli på EMB-agar, kraftigt laktosfermenterande

E. coli på EMB-agar är vanligen mörklila till blåsvart, ofta med ett mörkt centrum och en metalliskt grön glans från kraftig syraproduktion. Glansen är det välkända fynd som studenter letar efter, men betrakta den som stödjande belägg snarare än en definition. Glansens intensitet varierar med stam, inkubationstid, kolonitäthet och betraktningsvinkel. Avsaknad av glans utesluter inte E. coli, och en mörk koloni utan glans kan tyda på flera andra fermenterande organismer. Välj en väl isolerad koloni för eventuella uppföljande undersökningar i stället för att avläsa från ett område med tät tillväxt.

Platta 2: Klebsiella pneumoniae på EMB-agar, slemmig och fermenterande

Klebsiella pneumoniae på EMB-agar bildar vanligen stora, glänsande, slemmiga kolonier i rosa-lila till brunlila nyanser, ofta med mörka centra men vanligen utan stark metallglans. Liknande morfologi förekommer hos besläktade fermenterande organismer såsom Enterobacter. Slemmig konsistens och kolonistorlek ingår i avläsningen: en rosa koloni som är liten och platt har ett annat tolkningsvärde än en stor, välvd och slemmig koloni. Precis som för E. coli antyder plattan en fermentationsfenotyp, och identifiering på artnivå kräver biokemisk bekräftelse enligt beskrivningen nedan.

Platta 3: Salmonella på EMB-agar och andra icke-fermenterande organismer, färglösa kolonier

Salmonella på EMB-agar och besläktade icke-laktosfermenterande organismer, däribland Shigella och många Pseudomonas-isolat, växer vanligen som färglösa till genomskinliga eller ljust bärnstensfärgade kolonier. Vissa formuleringar och förhållanden ger en svagt rosa ton, så en ljusrosa koloni är inte automatiskt fermenterande. EMB skiljer inte Salmonella från Shigella eller från andra icke-fermenterande organismer; den åtskillnaden görs med senare tester. Observera också att laktospositiva Salmonella-stammar med E. coli-liknande metallglänsande kolonier har dokumenterats, vilket är ytterligare ett skäl till att en enda platta inte kan ge ett slutgiltigt svar.

Platta 4: Serratia marcescens och formuleringsfällan

Serratia marcescens får ett eget avsnitt eftersom studenter ofta förväntar sig röda kolonier och sedan feltolkar plattan. De flesta kliniska isolat fermenterar inte laktos, så på Levine EMB ser de ofta bleka till svagt färgade ut. Eftersom många isolat fermenterar sackaros kan en sackaroshaltig formulering ge en mörkare eller mer syrabetingad reaktion. Förvänta dig inte heller det klassiska röda pigmentet prodigiosin vid 35 till 37 C; pigmentproduktionen är inte tillförlitlig vid inkubatortemperatur. När protokollet nämner Serratia marcescens på EMB-agar ska du kontrollera vilken formulering påståendet förutsätter. En översikt av Serratias metabolism sammanfattar det laktosnegativa och sackarosvariabla mönstret bakom denna fallgrop.

Platta 5: kontroller och hämmade organismer

Grampositiva organismer såsom Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus och Bacillus hämmas i allmänhet helt eller kraftigt på EMB-agar, även om hämningen inte är fullständig för varje stam. En uppsättning kontroller gör avläsningen tillförlitlig: E. coli-kontrollen ska visa god tillväxt med blåsvart färg och glans, den icke-fermenterande kontrollen ska visa färglös tillväxt och hämningskontrollen ska visa liten eller ingen tillväxt. Om hämningskontrollen växer bra har selektionen misslyckats, och alla andra avläsningar från den satsen blir osäkra. Färgningsmetoder besvarar en annan fråga än odlingsmedier; för laboratoriets objektglasfärgning, se atlasen över metylenblåttfärgning.

Jämförelse med tydliga begränsningar

Tre meningar sammanfattar de missvisande utseendena. Mörk färg är inte detsamma som E. coli, eftersom Klebsiella, Enterobacter och andra fermenterande organismer utvecklar mörka centra utan glans. Rosa är inte detsamma som Klebsiella, eftersom måttligt eller långsamt fermenterande organismer och vissa organismer som normalt räknas som icke-fermenterande ser rosa eller lavendelfärgade ut. Glans är inte en definitiv identifiering av E. coli, eftersom andra kraftigt fermenterande organismer kan ge samma glans. Undervisningsprotokollet och dess bilder av blandkulturer illustrerar var och en av dessa feltolkningar.

Begränsningar för bekräftelse

EMB-agar visar en fenotyp, inte en art. Olika organismer kan ha samma koloniutseende, och en och samma organism kan avvika från läroboksbilden beroende på stam, ålder, tät tillväxt, formulering och inkubation. Därför behandlas EMB-morfologi som preliminär i undervisnings- och kliniska arbetsflöden.

Ett välgrundat arbetsflöde för studenter är att beskriva den isolerade kolonin (storlek, färg, centrum, glans i snett infallande ljus, slemmig karaktär), anteckna formulering, inkubationstid och temperatur samt kontroller och därefter renodla en väl isolerad koloni före eventuella bekräftande tester. Vanlig uppföljning omfattar gramfärgning tillsammans med IMViC-reaktioner för preliminär identifiering av E. coli och koliforma bakterier, TSI eller KIA och organismspecifika biokemiska paneler för tarmbakterier, med serologisk identifiering, MALDI TOF eller annan validerad identifiering när uppgiften kräver det. För bakgrund till hur EMB passar in bland selektiva och differentiella medier för tarmbakterier, se introduktioner till odlingsmedier för tarmbakterier och uppföljning med gramfärgning. För den närliggande frågan om vad en blå färgning av ett objektglas kan och inte kan bevisa håller atlasen över metylenblåttfärgning på samma sätt isär observation och slutsats.

Skriv observationen före slutsatsen. ”Mörkt blåsvarta kolonier med vinkelberoende grön glans på Levine EMB efter 24 timmar, förenligt med kraftig laktosfermentation” är en välgrundad formulering. ”E. coli, bekräftad” kräver det bekräftelsesteg som plattan ensam inte kan ge.