Naha métilén biru bisa ngalangkungan Kompléks III mitokondria? Naha hasil panalungtikan béda

Dua laboratorium nalungtik naha métilén biru bisa ngalangkungan Kompléks III mitokondria anu dihambat. Nu hiji ngajawab henteu. Nu séjén ngajawab enya. Duanana boga data.

Panalungtikan kahiji, dina mitokondria uteuk beurit leutik, manggihan yén zat warna éta henteu bisa ngalakukeunana. Panalungtikan kadua, dina mitokondria uteuk tina tilu spésiés rodénsia, manggihan yén zat warna éta sabagian bisa ngalakukeunana. Panalungtikan katilu, dina ati beurit leutik, mindeng dicutat dina bahasan anu sarua, padahal nguji hal séjén. Tempatkeun éta panalungtikan luyu jeung kontéksna, tuluy satengah tina kabingungan jadi écés.

Teu aya mékanisme universal anu bisa diumumkeun. Anu aya téh tilu ékspérimén kalayan panghambat, dosis, jeung hasil ukur anu béda. Baca heula kaayaan ékspériménna. Kacindekanana nuturkeun éta kaayaan.

Harti jalur pintas di dieu

Éléktron asup kana ranté ngaliwatan Kompléks I (tina NADH) atawa Kompléks II (tina suksinat), ngaliwatan Kompléks III ka sitokrom c, tuluy ngaliwatan Kompléks IV ka oksigén. Gradién anu kabentuk sapanjang jalur éta dipaké ku sél pikeun nyieun ATP.

Klaim jalur pintas nyebutkeun yén métilén biru nyokot éléktron di bagian saméméh hambatan sarta masrahkeunana di bagian sanggeus hambatan. Zat warna anu kaoksidasi narima éléktron tina NADH atawa komponén awal ranté, jadi leukométilén biru, sarta wangun anu karéduksi masrahkeun éléktron éta ka sitokrom c atawa balik deui kana ranté. Lamun éléktron dipasrahkeun di bagian sanggeus hambatan, réspirasi jeung poténsial mémbran pulih sabagian. Lamun dipasrahkeun dina tempat hambatan atawa saméméhna, euweuh anu pulih.

Hiji rinci ngeunaan Kompléks III nangtukeun sabagian gedé tina ieu pasualan. Kompléks éta ngajalankeun siklus Q kalayan dua situs panghambat. Antimisin ngabeungkeut situs Qi. Miksotiazol ngabeungkeut situs Qo. Panalungtikan anu ngan maké salah sahijina ngan nguji satengah tina kompléks éta.

Panalungtikan kahiji: euweuh jalur pintas dina mitokondria uteuk beurit leutik

Gureev jeung batur-baturna maké mitokondria kortéks tina beurit leutik C57BL/6, diisolasi ku digitonin, sarta diuji dina konséntrasi protéin 0.1 mg per ml. Substrat ngawengku tilu kaayaan: piruvat ditambah malat masing-masing 5 mM, suksinat 10 mM jeung glutamat 2 mM, sarta L-prolin 10 mM. Panghambatna nyaéta rotenon 1 micromolar (Kompléks I) jeung antimisin 1 microgram per ml (Kompléks III). Dosis zat warna nyaéta 0.5, 1, jeung 2 micromolar, kalayan 1 micromolar minangka konséntrasi utama. Métode jeung kurva rékaman aya dina laporan FEBS Letters.

Jalur pintas Kompléks I hasil. Rotenon nurunkeun réspirasi anu dirangsang ku ADP tina kira-kira 121 jadi kira-kira 2 nmol per minute per mg, sarta zat warna 1 micromolar mulangkeunana jadi kira-kira 21. Poténsial mémbran pulih dina piruvat ditambah malat sarta dina L-prolin.

Jalur pintas Kompléks III henteu hasil. Antimisin nurunkeun réspirasi jadi kira-kira 16, sarta zat warna ngan ningkatkeunana jadi kira-kira 20. Poténsial mémbran henteu pulih dina substrat mana waé, sanajan dosis zat warna nepi ka 5 micromolar. Data péroksida ogé nunjuk ka arah anu sarua: zat warna nyalira ningkatkeun émisi péroksida tina laju dasar deukeut 76 pmol per minute per mg jadi kira-kira 1170, 1460, jeung 1945 dina tilu dosis éta, tapi antimisin nurunkeun sinyal anu dipicu ku zat warna éta masing-masing kira-kira 25, 88, jeung 96 percent. Lamun zat warna anu karéduksi ngaréaksi langsung jeung oksigén, ngahambat Kompléks III sakuduna henteu ngurangan sinyal éta. Para pangarang nyimpulkeun yén zat warna anu karéduksi dioksidasi dina situs Qo Kompléks III, di bagian saméméh hambatan antimisin. Puteran pondokna, ku kecap: donor ka zat warna, zat warna ka Qo, tuluy neruskeun jalur normal. Rotenon bisa dilangkungan. Antimisin henteu.

Panalungtikan kadua: jalur pintas sabagian dina tilu spésiés, dina duanana situs panghambat

Svab jeung batur-baturna ngalegaan rancangan panalungtikan. Mitokondria uteuk tina beurit leutik, beurit gedé, jeung marmot, diisolasi ku Percoll, diuji dina konséntrasi anu sarua, 0.1 mg per ml, kalayan piruvat ditambah malat atawa glutamat ditambah malat, masing-masing 5 mM. Maranéhna maké dua panghambat Kompléks III: antimisin A 0.3 micromolar jeung miksotiazol 1 micromolar. Zat warna dipaké dina konséntrasi 2 micromolar dina kalolobaan uji, sarta 0.5 dina uji sitokrom c. Katilu spésiés kalayan protokol anu disaruakeun aya dina artikel aksés kabuka.

Duanana hambatan bisa dilangkungan sabagian, dina katilu spésiés. Dina mitokondria beurit leutik, antimisin ngahambat réspirasi sarta zat warna ningkatkeunana kira-kira 60 percent, tina kira-kira 37 jadi 59 nmol per minute per mg. Miksotiazol ngahambat réspirasi 88 percent, jadi kira-kira 4.5, sarta zat warna ningkatkeunana lima kali lipet jadi kira-kira 23. Poténsial mémbran ngalaman répolarisasi sabagian dina ayana salah sahiji panghambat, diukur ku dua zat warna (safranin O jeung TMRM rasiométrik) pikeun ngaleungitkeun kamungkinan artéfak optik.

Artikel ieu ogé nguji langsung prosés masrahkeun éléktron, anu henteu kungsi dilakukeun dina panalungtikan kahiji. Sitokrom c éksogén anu diasétilasi dina konséntrasi 25 micromolar henteu diréduksi ku mitokondria anu boga énergi, boh aya panghambat boh henteu, tapi nambahkeun zat warna nyababkeun réduksi dina duanana kaayaan. Dina larutan panyangga tanpa sél, NADH ditambah zat warna ngaréduksi sitokrom c dina laju anu sabanding jeung NADH. Luncatan anu leuwih jauh, ku kecap: ékivalén réduksi ka zat warna, zat warna langsung ka sitokrom c, Kompléks IV ka oksigén. Jalur éta ngalangkungan sakabéh Kompléks III, ku kituna duanana panghambat bisa dilangkungan.

Dua hasil ukur tambahan ngarojong éta tafsiran. Fluorésénsi NAD(P)H turun nalika zat warna ditambahkeun kana mitokondria anu dibéré miksotiazol, hartina ékivalén réduksi ngalir kaluar ngaliwatan jalur anyar. Sarta absorbansi zat warna dina 660 nm ngalacak unggal panambahan sacara runtuy, sedengkeun supernatan hasil séntrifugasi némbongkeun yén zat warna anu kaoksidasi ngumpul di jero mitokondria anu boga énergi nepi ka leuwih ti saratus kali lipet, tuluy kaluar nalika poténsialna runtuh. Itungan protonna ogé luyu: ngalangkungan léngkah-léngkah ngompa nyésakeun kira-kira 2 proton per pasangan éléktron, lain 10, jadi pamakéan oksigén anu leuwih gancang kalayan répolarisasi anu ngan sabagian téh ciri jalur pintas anu nyata, lain bukti anu ngalawan ayana jalur pintas.

Preparat anu sarua ngahasilkeun réspon anu bisa nyasabkeun lamun dibaca sakolébat. Kalayan panghambat ditambah zat warna, ADP malah nurunkeun réspirasi, lain ningkatkeunana, sarta hambatan transpor malah ngarangsang réspirasi, lain ngalambatkeunana, sedengkeun poténsial mémbran tetep robah ka arah anu normal. Konsumsi oksigén nyalira bisa nyasabkeun dina sistem ieu.

Panalungtikan katilu: panalungtikan ati anu nguji Kompléks I jeung II, lain III

Lee jeung Boelsterli maké mitokondria ati beurit leutik sarta hépatosit anu dikultur, anu diruksak ku éfavirénz (Kompléks I, IC50 deukeut 30 micromolar) jeung hidrazin, métabolit isoniazid (Kompléks II, IC50 deukeut 30 micromolar). Zat warna dina konséntrasi kira-kira 30 micromolar mulangkeun oksidasi NADH, poténsial mémbran, jeung ATP bari nurunkeun oksidan jeung maotna sél ku nékrosis. Artikel Redox Biology ngamodélkeun éta minangka zat warna anu mawa éléktron ngalangkungan Kompléks I jeung II anu ruksak.

Éta hasil mangrupa kontéks bagian hulu anu geus disapukan, sarta henteu ngajelaskeun nanaon ngeunaan Kompléks III sabab teu aya anu dihambat dina éta bagian. Éta henteu bisa mastikeun atawa ngabantah salah sahiji panalungtikan uteuk.

Matriks kaayaan

Opat alesan naha duanana panalungtikan Kompléks III bisa bener pikeun kaayaan ékspériménna séwang-séwangan

1. Panghambatna lain intervensi anu sarua. Antimisin nyalira dina konséntrasi 1 microgram per ml dibandingkeun jeung antimisin 0.3 micromolar ditambah panghambat situs Qo anu misah. Jalur zat warna anu ngalirkeun éléktron ka situs Qo gagal persis dina tempat jalur langsung ka sitokrom c hasil. Hiji situs henteu bisa ngawakilan duanana.

2. Dosis zat warna jeung waktuna béda. Konséntrasi utama 1 dibandingkeun jeung 2 micromolar, dina zat anu ngalakonan siklus rédoks sarta nyerepna jeung réduksi langsung sitokrom c ku éta zat gumantung kana konséntrasi jeung waktu. Béda dosis anu leutik ditambah béda waktu pangukuran bisa némbongkeun cabang anu béda tina hiji jaringan.

3. Preparatna béda. Isolasi ku digitonin dibandingkeun jeung isolasi gradién Percoll milih populasi mitokondria anu tumpang tindih tapi henteu idéntik. Konséntrasi protéin disaruakeun dina 0.1 mg per ml, jadi variabel éta henteu jadi panyabab bédana, tapi subpopulasi jeung integritasna tetep bisa béda. Sarta dugaan yén spésiés jadi panyabab geus disingkirkeun: kelompok kadua ogé ngahasilkeun deui fénotipna dina beurit leutik.

4. Kaayaan substrat nangtukeun naon anu bisa dilakukeun ku zat warna. Tilu kaayaan substrat dibandingkeun jeung pasangan anu patali jeung NADH. Pasokan NADH jeung poténsial mémbran babarengan nangtukeun sabaraha gancang zat warna diréduksi jeung di mana éta zat sumebar, sarta jalur anu merlukeun zat warna karéduksi di gigireun sitokrom c kaoksidasi gumantung pisan kana éta pilihan.

Kumaha maca klaim jalur pintas salajengna

Tanyakeun kompléks mana anu dihambat, ku panghambat naon, dina situs mana jeung dosis sabaraha. Tanyakeun konséntrasi zat warna sarta iraha pangukuran dilakukeun. Tanyakeun jaringan, spésiés, cara isolasi, konséntrasi protéin, jeung substratna. Sarta tanyakeun naha poténsial, réspirasi, kaayaan rédoks, jeung uji langsung masrahkeun éléktron némbongkeun hasil anu saluyu, sabab konsumsi oksigén nyalira leuwih ti sakali nunjuk ka arah anu salah di dieu.

Ringkesan anu kawates ieu tetep sah. Jalur pintas zat warna ngaliwatan Kompléks I geus disapukan. Pikeun Kompléks III, mitokondria beurit leutik kalayan antimisin 1 microgram per ml jeung zat warna 1 micromolar henteu némbongkeun jalur pintas anu fungsional, sedengkeun tilu spésiés kalayan antimisin 0.3 micromolar atawa miksotiazol 1 micromolar jeung zat warna 2 micromolar némbongkeun jalur pintas sabagian kalayan mindahkeun éléktron langsung tina zat warna ka sitokrom c. Éta dua pernyataan bisa sarua bener. Sagala kacindekan anu leuwih lega mangrupa ékstrapolasi.

Bacaan anu patali ngajaga klaim anu dipadungdengkeun tetep dina wates kimia anu henteu dipadungdengkeun: kumaha métilén biru mindahkeun éléktron pikeun prosés estafétana, ékspérimén jalur pintas Kompléks I pikeun kasus bagian hulu anu geus disapukan, hasil ukur poténsial mémbran jeung artéfakna pikeun ngajelaskeun naha diperlukeun dua zat warna, sarta cara nanganan zat anu ngalakonan siklus rédoks di laboratorium pikeun nyingkahan kasalahan dosis jeung waktu.