Artikel
Alternatif pikeun methylene blue dina mikroskopi: pilih dumasar tugas
Pikeun apusan baktéri basajan, crystal violet bisa ngagantikeun methylene blue lamun tujuanana pikeun ningali wangun sél. Pikeun sél hirup, alternatif anu leuwih cocog bisa jadi phase contrast tanpa pewarna pisan. Pilihanna gumantung kana observasi anu kudu dilakukeun.
Anggap aya dua jalma anu nalungtik kultur baktéri anu sarua. Hiji hayang ngabédakeun sél wangun batang jeung sél buleud. Nu séjén hayang nyaho naha hiji perlakuan geus maéhan baktéri. Pewarna anu méré gambar écés ka jalma kahiji bisa jadi henteu méré jawaban anu bisa dipaké ku jalma kadua.
Saméméh milih pangganti, lengkepan kalimah ieu: “Kuring kudu niténan ___ dina ___, sarta sél kudu / teu kudu tetep hirup.” Kalimah éta nangtukeun tugas anu kudu dipigawé ku pewarna.
Mimitian ku spésimén jeung patalékan
Mimitina tangtukeun naha sél kudu tetep hirup, tuluy idéntifikasi fitur anu kudu dititénan:
- Sél kudu tetep hirup: pikeun gerakan atawa wangun, pertimbangkeun phase contrast tanpa pewarna atawa DIC; pikeun DNA inti, pertimbangkeun Hoechst 33342 kalayan fluoresensi; pikeun integritas mémbran, pilih uji anu geus divalidasi saperti SYTO 9 kalayan propidium iodide.
- Sél teu kudu tetep hirup: pikeun morfologi baktéri, pertimbangkeun pewarnaan basajan crystal violet atawa pewarnaan négatif nigrosin; pikeun réaksi Gram, paké métode pewarnaan Gram lengkep; pikeun DNA inti dina sél anu difiksasi, pertimbangkeun fluoresensi DAPI.
Paké tabel ieu pikeun ngabandingkeun watesan unggal cabang. Ieu téh pilihan métode, lain parentah pikeun ngaganti botol dina protokol anu geus aya.
| Naon anu kudu dititénan | Spésimén jeung alat | Alternatif anu bisa dipilih | Watesan utama |
|---|---|---|---|
| Wangun jeung susunan baktéri | Apusan baktéri anu geus disiapkeun; brightfield | Pewarnaan basajan crystal violet | Némbongkeun morfologi; henteu netepkeun réaksi Gram atawa viabilitas. |
| Garis luar sél dina latar poék | Preparat bakteriologis; brightfield | Pewarnaan négatif nigrosin | Cara nyiapkeun jeung formulasi penting; sél anu henteu kakeunaan pewarna teu merta hirup. |
| Réaksi Gram | Apusan baktéri anu geus disiapkeun; brightfield | Métode pewarnaan Gram lengkep | Merlukeun runtuyan réagen lengkep jeung kontrol. |
| Gerakan atawa parobahan dina sél hirup | Preparat baseuh anu cocog; phase contrast atawa DIC | Tanpa pewarna | Merlukeun optik anu cocog; kontras henteu ngaidéntifikasi hiji molekul. |
| DNA inti | Sél anu difiksasi; fluoresensi | DAPI | Merlukeun filter éksitasi jeung émisi anu cocog. |
| DNA inti dina sél hirup | Sél hirup; fluoresensi | Hoechst 33342 | Kamampuh asup kana sél henteu ngabuktikeun yén kaayaan pencitraan henteu ngabahayakeun. |
| Integritas mémbran baktéri | Baktéri anu teu difiksasi; fluoresensi | SYTO 9 kalayan propidium iodide | Pewarnaan mémbran mangrupa ukuran henteu langsung pikeun viabilitas. |
Pikeun apusan basajan, ganti métodena kalayan taliti
Crystal violet mangrupa calon anu praktis lamun tugasna nyaéta meunangkeun tampilan hiji warna pikeun morfologi baktéri. Bacteriological Analytical Manual ti FDA ngadaptarkeun dua formulasi crystal violet anu cocog pikeun pewarnaan basajan. Paké formulasi anu didokumentasikeun jeung métode persiapanana; ngaran pewarna wungkul henteu nangtukeun réagen kerja.
Crystal violet ogé dipaké dina pewarnaan Gram, tapi éta henteu ngajadikeun pewarnaan basajan crystal violet jadi pewarnaan Gram. Dina protokol pewarnaan Gram ASM, hasil diferensial gumantung kana crystal violet, iodine, dekolorisasi, jeung counterstaining anu dipaké sacara runtuy. Ngaleungitkeun léngkah-léngkah éta ngarobah naon anu bisa dibuktikeun ku gambar. Tingali pewarnaan basajan dibandingkeun jeung pewarnaan Gram pikeun bédana éta.
Nigrosin nawarkeun cara séjén pikeun némbongkeun garis luar: latarna dijieun poék sedengkeun sél baktéri tetep kawilang caang. Aya hiji rinci anu mangpaat dina parentah nigrosin ti Merck anu bisa kaliwat dina daptar pangganti umum. Formulasi kerja anu ditangtukeun ngandung formaldehyde. Ku kituna, kasaluyuan pikeun sél hirup henteu bisa disimpulkeun ngan tina istilah “pewarnaan négatif,” sanajan sélna sorangan katingali henteu kakeunaan pewarna. Pariksa formulasi lengkep jeung persiapan spésimén.
Pikeun spésimén hirup, pertimbangkeun ngarobah optik
Lamun rék niténan sél gerak atawa ngabagi, nambahkeun pewarna séjén bisa nyusahkeun observasi. Sakumaha dijelaskeun ku Nikon dina pituduhna ngeunaan kontras dina spésimén transparan, phase contrast jeung differential interference contrast, atawa DIC, ngajadikeun spésimén katingali ngaliwatan bédana sipat optikna. Métode ieu bisa némbongkeun sél hirup tanpa pewarna, salami mikroskopna miboga komponén anu diperlukeun.
Pilihan ieu ngajaga preparat tetep tanpa pewarna, tapi ngarobah informasi anu sadia. Anjeun bisa nuturkeun wates sél atawa hiji gerakan tanpa nyaho molekul mana anu ngahasilkeun kontras éta. Lamun patalékanna ngeunaan lokasi molekul, pilih métode pelabelan anu cocog.
Pikeun DNA inti, babandingan pewarna DAPI jeung Hoechst ti Invitrogen ngabédakeun pamakéan umum DAPI pikeun sél anu difiksasi jeung Hoechst 33342 anu leuwih gampang nembus sél sarta leuwih dipikaresep pikeun pelabelan sél hirup. Duanana merlukeun alat fluoresensi. Duanana ogé lain pangganti langsung pikeun pewarna warna dina brightfield.
Anggap paparan pewarna jeung iluminasi minangka kaayaan ékspérimén. Bandingkeun preparat anu diwarnaan jeung anu henteu diwarnaan lamun paripolah sél mangrupa ukuran anu keur dititénan.
Sél beureum teu otomatis mangrupa sél paéh
SYTO 9 jeung propidium iodide mindeng dipaké babarengan pikeun meunteun integritas mémbran baktéri. Manual BacLight ngahubungkeun mémbran anu utuh jeung pewarnaan héjo, sarta mémbran anu ruksak jeung pewarnaan beureum. Tafsiran éta perlu divalidasi pikeun spésimén anu dipaké.
Hiji studi taun 2019 ku Rosenberg jeung kolegana ngagambarkeun masalahna. Dina biofilm E. coli umur 24 jam dina kaca di phosphate-buffered saline, kira-kira 96% sél katingali positif propidium iodide sacara in situ. Tapi panulis ngira-ngira yén 82% masih bisa dikultur sanggeus dipanén. Gambar confocal némbongkeun sél kalayan bagian jero héjo di handapeun bahan anu diwarnaan beureum, anu nunjukkeun yén asam nukléat ekstrasélular milu nyababkeun sinyal anu nyasabkeun.
Perséntase éta ngajelaskeun pangukuran anu béda dina preparat studi éta, lain faktor koreksi universal. Palajaran anu mangpaat nyaéta mariksa naon anu ngahasilkeun sinyal. Dina biofilm, pewarna asam nukléat bisa ngadeteksi bahan di luar sél ogé di jero sél anu ruksak. Pikeun nyieun kacindekan ngeunaan viabilitas, panalungtik nyarankeun pangukuran pelengkap, saperti kultivasi atawa aktivitas métabolik, bari ngaku yén unggal métode miboga watesan.
Pariksa naon sabenerna eusi alternatifna
Métode pewarnaan alternatif masih bisa ngandung methylene blue. Giemsa mangrupa salah sahiji conto: Merck ngajelaskeun produkna minangka larutan azure-eosin-methylene-blue, anu ditujukeun pikeun aplikasi kaasup apusan getih jeung sumsum tulang. Ieu bisa jadi métode anu béda pikeun spésimén anu béda, tapi henteu nyumponan sarat pikeun ngaluarkeun methylene blue.
Lamun ngaluarkeun hiji sanyawa mangrupa bagian tina ékspérimén, pariksa idéntitas jeung formulasi réagen saméméh ngabandingkeun gambar. Pituduh ngeunaan methyl blue, methylene blue, jeung pewarna séjén anu ngaranna sarupa ngabahas bédana dina panamaan.
Verifikasi panggantian saméméh ngagunakeun hasilna
Pikeun métode anyar, jieun babandingan skala leutik maké spésimén anu ngawakilan jeung kontrol anu cocog. Jaga setélan mikroskop tetep sabanding lamun mungkin. Catet formulasi réagen, persiapan spésimén, paparan, jeung kaayaan pencitraan supaya gambar anu katingali leuwih hadé bisa ditalungtik, lain ngan saukur dipikaresep.
Nilai kasuksésan dumasar kana patalékan aslina. Pikeun morfologi, peunteun naha wates sél jeung susunanana tetep bisa diinterpretasi. Pikeun pelabelan inti, peunteun lokasi sinyal jeung latarna. Pikeun viabilitas, merlukeun bukti salian ti pamisahan warna anu katingali hadé. Pituduh anu leuwih lega ngeunaan pewarnaan methylene blue jeung aplikasi laboratorium ngajelaskeun kumaha observasi jeung persiapan silih patali.
Pilih alternatif anu ngajaga pangukuran anu anjeun peryogikeun. Warna ngan saukur salah sahiji sipat tina gambar anu dihasilkeun.