Da li veća potrošnja kiseonika znači više ATP-a? Pouke iz studija o metilenskom plavom

Izolovana mitohondrija nalazi se u komori sa gorivom, ali bez ADP-a. Kiseonik troši sporo. Kada se doda ADP, potrošnja kiseonika poraste nekoliko puta. Kada se sačeka da se ADP potroši, potrošnja kiseonika ponovo opadne. Gorivo se nije promenilo. Promenila se samo potreba za ATP-om.

Taj kratki sled događaja obuhvata celu razliku kojom se ovaj članak bavi. Potrošnja kiseonika meri brzinu kojom elektroni prolaze kroz respiratorni lanac do kiseonika. Proizvodnja ATP-a meri koliko se energije tog protoka očuva u upotrebljivom obliku. Ova dva procesa dele međukorak, protonski gradijent preko unutrašnje mitohondrijske membrane, i sve što menja stepen sprezanja tog gradijenta sa sintezom ATP-a može pomeriti ova dva krajnja pokazatelja u različitim smerovima. Metilensko plavo je ovde poučan primer jer je zabeleženo da radi i jedno i drugo: u nekim preparatima povećava potrošnju kiseonika zajedno sa ATP-om, a u drugima povećava potrošnju kiseonika dok ATP ostaje nepromenjen ili opada.

Čitaoci koji najpre žele širu sliku prenosa elektrona mogu početi od objašnjenja kako metilensko plavo prenosi elektrone kroz respiratorni lanac, a oni koji žele da upoznaju terminologiju ranih eksperimenata s kiseonikom mogu pročitati šta su prva merenja respiracije zaista pokazala.

Respiracija, ATP i gradijent između njih

Elektroni iz NADH i FADH2 ulaze u lanac na kompleksima I i II, prolaze kroz kompleks III do citohroma c, a zatim kroz kompleks IV do kiseonika. Energija oslobođena na kompleksima I, III i IV pumpa protone iz matriksa u međumembranski prostor. To razdvajanje naboja i kiselosti čini protonsku pokretačku silu, a njen električni deo, membranski potencijal, obično je dominantan.

ATP sintaza omogućava protonima da se vrate u matriks i koristi oslobođenu energiju da spoji ADP i fosfat u ATP. Dakle, sled je:

potrošnja kiseonika, zatim pumpanje protona, zatim gradijent, zatim sinteza ATP-a.

Problem je u tome što protoni mogu da se vrate i drugim putevima. Svaki povratak koji zaobilazi ATP sintazu predstavlja curenje protona. Curenje primorava lanac da ponovo pumpa iste protone kako bi održao stabilan membranski potencijal, što troši više kiseonika bez stvaranja više ATP-a. Dovoljno snažno curenje predstavlja rasprezanje: potrošnja kiseonika raste dok ATP ostaje nepromenjen ili opada, a izgubljena energija se oslobađa kao toplota.

Stanje 3, stanje 4 i odnos respiratorne kontrole

Klasična terminologija za ove procese potiče iz istraživanja izolovanih mitohondrija. Stanje 3 je respiracija u prisustvu supstrata i ADP-a: ATP sintaza smanjuje gradijent, membranski potencijal opada, lanac ubrzava kako bi ga obnovio, a potrošnja kiseonika je visoka jer se stvara ATP. Stanje 4 je respiracija nakon što se ADP potroši: ATP sintaza miruje, gradijent raste, visok membranski potencijal otežava dalje pumpanje, a potrošnja kiseonika pada na nivo potreban da se nadoknadi curenje.

Odnos respiratorne kontrole, stanje 3 podeljeno stanjem 4, zato pokazuje koliko je čvrsto sprezanje u preparatu. Visok odnos znači da ADP snažno kontroliše respiraciju. Opadanje tog odnosa uz porast respiracije u stanju 4 znači da curenje preuzima glavnu ulogu. Iz tog ugla postaju razumljivi rezultati s metilenskim plavim opisani u nastavku.

Vredi zapamtiti jedan mentalni model. Visok membranski potencijal usporava lanac. Rasipanje potencijala ga ubrzava. Lanac reaguje na to koliko je pumpanje postalo teško, a ne neposredno na to da li se stvara ATP.

Kada se krajnji pokazatelji menjaju zajedno

Najjasniji primer sprezanja potiče iz istraživanja izolovanih mitohondrija mozga zamorca sa blokiranim respiratornim kompleksima. Pri koncentracijama metilenskog plavog od 100 nanomolara do 1 mikromolara, potrošnja kiseonika u mirovanju rasla je kada su kao gorivo korišćeni glutamat uz malat, sukcinat ili glicerofosfat, dok je respiracija stimulisana ADP-om ostala nepromenjena. U mitohondrijama otrovanim na nivou kompleksa I ili kompleksa III, boja je umereno povećala proizvodnju ATP-a, obnovila membranski potencijal i poboljšala preuzimanje kalcijuma. Predloženi put je prečica: boja prihvata elektrone pre mesta blokade i predaje ih citohromu c, zaobilazeći oštećeni kompleks.

Drugi primer u kome se pokazatelji menjaju zajedno koristi potpuno drugačiji izvor ATP-a. U izolovanim mitohondrijama mozga sa inhibiranom ATP sintazom, metilensko plavo je i dalje stimulisalo respiraciju na svakom ispitivanom supstratu. Međutim, sinteza ATP-a porasla je samo uz alfa-ketoglutarat i glutamat, dva supstrata iz kojih nastaje sukcinil-CoA. Kada je oligomicin blokirao ATP sintazu, dodatni ATP nastajao je fosforilacijom na nivou supstrata koju obavlja sukcinil-CoA ligaza u ciklusu limunske kiseline, a ne oksidativnom fosforilacijom. Boja je takođe obnovila membranski potencijal kada su kompleks I i ATP sintaza bili istovremeno inhibirani. Ovde su se potrošnja kiseonika i ATP menjali zajedno, ali samo tamo gde je supstrat omogućavao drugi put stvaranja ATP-a. Uz sukcinat ili malat, respiracija je rasla bez dodatnog ATP-a. Ista boja, ista komora, drugačije gorivo, drugačiji odgovor.

Kada se krajnji pokazatelji razilaze

Primeri razilaženja takođe su objavljeni i podjednako su poučni. U studiji izolovanih mitohondrija jetre pacova iz 1997, metilensko plavo je ubrzalo respiraciju u stanju 4 kod čvrsto spregnutih mitohondrija koje su koristile sukcinat, čime je smanjilo odnos respiratorne kontrole. Efekat je bio vidljiv od 0.5 mikromolara, a snažan pri 5 mikromolara, koncentraciji bliskoj nivoima u plazmi nakon intravenskog bolusa od 100 miligrama. Pri 5 mikromolara mitohondrije su i bubrile, mada se poremećaj sprezanja prvo pojavio pri nižim koncentracijama, što ukazuje da je curenje prethodilo strukturnom oštećenju, umesto da je nastalo zbog njega. U raspregnutim mitohondrijama boja je stimulisala respiraciju na način koji je zavisio od koncentracije i dostizao zasićenje. Potrošnja kiseonika porasla je u oba preparata. Sinteza ATP-a po utrošenom kiseoniku nije. To je školski primer rasprezanja i prenosa elektrona, u istom molekulu.

Najupečatljivije razilaženje potiče iz mrežnjače. Kod miševa sa nedostatkom AIF-a i fotoreceptorskih ćelija tretiranih rotenonom, metilensko plavo je očuvalo debljinu mrežnjače, markere fotoreceptora i strukturu mitohondrija, a smanjilo je odnos NADH prema NAD i ublažilo puteve odgovora na stres, uključujući odgovor na nesavijene proteine i mitofagiju. To je postiglo bez otklanjanja manjka ATP-a. Zaštita bez obnavljanja energije znači da je korist ostvarena preko redoks ravnoteže i integriteta mitohondrija, a ne preko dodatnog ATP-a. Svako ko bi preživljavanje tkiva izjednačio sa obnovljenom proizvodnjom energije potpuno bi pogrešno protumačio taj eksperiment.

Istraživanje mitohondrija mozga dodaje ovom bilansu i kolonu troškova. Iste niske koncentracije koje su poboljšale bioenergetiku takođe su povećale stvaranje vodonik-peroksida u svim ispitivanim uslovima i usporile njegovo uklanjanje, što je mereno kalibrisanim Amplex testom, a ne nespecifičnom bojom. Više ATP-a i više oksidansa išli su zajedno.

Praktična kontrolna lista za čitanje

Četiri pitanja razdvajaju rezultat sa očuvanim sprezanjem od rezultata sa rasprezanjem.

Prvo, koji je krajnji pokazatelj zaista meren. Sama potrošnja kiseonika ne može pokazati količinu ATP-a. Sinteza ATP-a, membranski potencijal i odnos respiratorne kontrole dodaju po jedan deo slike koji kiseonična elektroda ne može da vidi. Vodič za čitanje tvrdnji iz istraživanja metilenskog plavog detaljno objašnjava ovaj pristup krajnjim pokazateljima.

Drugo, koji je supstrat hranio mitohondrije. Rezultat sa sukcinil-CoA pokazuje da izbor goriva može odlučiti da li dodatna respiracija uopšte može da dovede do dodatnog ATP-a.

Treće, koja je koncentracija korišćena. Metilensko plavo u nanomolarnim do niskim mikromolarnim koncentracijama u mitohondrijama mozga donelo je umerena bioenergetska poboljšanja uz cenu povećanja oksidansa; pola mikromolara i više u mitohondrijama jetre narušavalo je sprezanje; 5 mikromolara je dovelo i do bubrenja. Koncentracija je deo mehanizma, a ne sporedan detalj.

Četvrto, na kom je modelu rezultat dobijen. Izolovane mitohondrije otkrivaju kako su procesi povezani, ali cele ćelije i tkiva uvode i transport, redukciju u bezbojni oblik i konkurentne puteve koji prihvataju elektrone. Laboratorijska istraživanja doziranja, uključujući to kako koncentracija i protokol oblikuju efekte metilenskog plavog, predstavljaju most između brojeva iz komore i bilo koje tvrdnje o osobi.

Potrošnja kiseonika pokazuje protok elektrona. ATP pokazuje koliko je energije tog protoka očuvano. Metilensko plavo može promeniti bilo koji od ova dva pokazatelja, a navedeni eksperimenti prikazuju sve četiri kombinacije: oba rastu, respiracija raste uz porast ATP-a samo tamo gde supstrat to omogućava, respiracija raste dok sprezanje slabi, i tkivo je očuvano dok ATP ostaje nepromenjen. Broj koji pokazuje kiseonična elektroda početak je tumačenja, a ne njegov kraj.