Metilensko plavo u istraživanjima moždanog udara i cerebralne hipoperfuzije: šta tri modela zaista pokazuju

Začepljena arterija, ćelijska kultura lišena hranljivih materija i pacov sa suženim vratnim arterijama zvuče kao tri verzije istog eksperimenta. Nisu. Svaki postavlja drugačije pitanje, a metilensko plavo u svakom daje drugačiji odgovor. Ako ih pomešamo, literatura deluje protivrečno. Ako ih razdvojimo, pojavljuje se jasan obrazac, kojim uglavnom upravlja vreme primene.

Upravo je to razdvajanje smisao ovog pregleda. Tri modela su akutni fokalni moždani udar, uskraćivanje kiseonika i glukoze uz ponovnu oksigenaciju ćelija u kulturi i hronična cerebralna hipoperfuzija tokom više nedelja. Predloženi mehanizam koji ih povezuje odnosi se na mitohondrije, ali se ishodi razlikuju jer se razlikuje i metabolički kontekst.

Tri modela odgovaraju na različita pitanja

Akutni fokalni moždani udar kod pacova obično se izaziva okluzijom srednje moždane arterije, skraćeno MCAO. Blokada nalik ugrušku stvara ishemijsko jezgro okruženo penumbrom, tkivom koje je ugroženo, ali se potencijalno može spasiti ako se protok obnovi. Ovde je pitanje da li neka intervencija usporava širenje infarkta ili čuva funkciju u periodu oko reperfuzije.

Uskraćivanje kiseonika i glukoze, skraćeno OGD, odvija se na sasvim drugom nivou. Moždane ćelije u kulturi izlažu se gotovo potpunom odsustvu kiseonika, bez glukoze, a zatim se vraćaju u normalan medijum. Nema ugruška, kolateralne cirkulacije, krvnog pritiska ni imunskog sistema. Pitanje je isključivo ćelijsko: šta se dešava sa ćelijskim disanjem, ATP-om i preživljavanjem kada supstrati nestanu, a zatim se ponovo pojave.

Za hroničnu cerebralnu hipoperfuziju koristi se trajna obostrana okluzija karotidnih arterija kod pacova, poznata kao model 2VO. Protok krvi u prednjem mozgu opada i ostaje nizak nedeljama. Nema iznenadnog fokalnog infarkta ni hitne reperfuzije. Pitanje je da li višenedeljna metabolička podrška čuva krvne sudove, mitohondrije i pamćenje tokom dugotrajnog smanjenog protoka.

Poboljšanje pamćenja posle jednog meseca tretmana u modelu 2VO zato ne govori ništa neposredno o spasavanju ljudskog mozga tokom hitne trombektomije. Ta razlika je važna jer je većina optimističnih sažetaka preskače.

Akutni moždani udar: zaštita pri reperfuziji, odlaganje bez nje

Najjasniji akutni rezultat potiče iz modela prolazne MCAO sa reperfuzijom. Pacovi su bili izloženi okluziji tokom 60 minuta, a zatim su intravenozno primili malu dozu metilenskog plavog počevši od reperfuzije, uz dodatne doze posle 3 sata i 2. dana. MRI je pokazao da je lezija u grupi koja je primala samo nosač do 2. dana porasla za oko 19 procenata, dok se u tretiranoj grupi smanjila za oko 17 procenata, uz približno 30 procenata manje konačne infarkte i bolje neurološke skorove 2. i 7. dana. Snimci su pokazali bolje očuvanje tkiva i u jezgru i u penumbri. Šira literatura o neuroprotekciji razmatra ovu zaštitu vezanu za vreme reperfuzije zajedno sa nalazima kod globalne ishemije i traume.

Slika se menja kada arterija ostane začepljena. U eksperimentu sa trajnom MCAO, metilensko plavo dato tokom ishemije usporilo je širenje lezije na difuzionim snimcima i nakratko produžilo nesklad između perfuzije i difuzije, uz nešto bolji lokalni protok, ali se konačna zapremina infarkta posle 24 sata nije značajno razlikovala. Odložilo je prelazak ugroženog tkiva u infarkt, ali nije zamenilo ponovno otvaranje krvnog suda.

Treća akutna studija pruža dodatne pojedinosti o mehanizmu i dozi. Jedna intraperitonealna doza neposredno posle okluzije pokazala je najveće smanjenje infarkta, oko 50 procenata, pri srednjoj dozi od 5 mg/kg, a ne pri 1 ili 10 mg/kg, uz bolje senzomotorne skorove. Autori su to povezali sa očuvanom strukturom mitohondrija i pojačanom mitofagijom, selektivnim uklanjanjem oštećenih mitohondrija. Doza, put primene i raspored zato imaju značaj, a vrednosti u mg/kg kod pacova nisu doze za moždani udar kod ljudi.

Ćelijska kultura: ista supstanca pomaže ili šteti u zavisnosti od vremena primene

Eksperiment sa astrocitima je najpoučniji i najčešće pogrešno citiran. Primarni kortikalni astrociti miša bili su izloženi teškom uskraćivanju tokom 6 sati pri 0.1 procenat kiseonika u medijumu bez glukoze, piruvata ili seruma, nakon čega je usledilo 24 sata ponovne oksigenacije uz vraćene supstrate. Oko polovine ćelija je uginulo, što testu ostavlja prostora da pokaže efekat u oba smera.

Kada je metilensko plavo bilo prisutno tokom faze uskraćivanja, preživljavanje se pogoršalo, a ne poboljšalo. Kada je umesto toga uvedeno pri ponovnoj oksigenaciji, niske mikromolarne koncentracije poboljšale su vijabilnost i povećale potrošnju kiseonika, unos glukoze i proizvodnju ATP-a. U normalnim uslovima iste koncentracije povećale su unos glukoze za približno 89 procenata pri 0.1 mikromolar i oko 200 procenata pri 1 mikromolar, uz očuvan glikogen i aktivnost heksokinaze posle povrede i bez izmerenog porasta superoksida.

Mehanizam je lakše razumeti kroz poređenje sa rezervnim generatorom. Metilensko plavo deluje kao alternativni prenosilac elektrona koji prihvata redukcione ekvivalente i prenosi ih ka citohromu c i kompleksu IV, čime podržava tok elektrona i sintezu ATP-a, uz smanjenje curenja elektrona u ranijim delovima lanca. Tokom teškog uskraćivanja ta stimulacija predstavlja nepovoljan faktor jer povećava metaboličke potrebe kada kiseonika i glukoze gotovo nema, što može brže iscrpeti poslednje rezerve. Kada se supstrati vrate, isto svojstvo postaje prednost jer pomaže oštećenim mitohondrijama da efikasno koriste ponovo dostupne kiseonik i glukozu. Zato se i nalazi iz objašnjenja mitohondrijskog prenosa elektrona moraju razmatrati u kontekstu uskraćivanja.

Jedna napomena: ovo pravilo o vremenu primene važi za taj konkretan eksperimentalni sistem sa astrocitima. Prateća ćelijska studija sa drugačijim tipom ćelija, blažim uskraćivanjem i nižom koncentracijom utvrdila je zaštitu čak i pri izlaganju tokom uskraćivanja. Tip ćelija, preostali kiseonik, koncentracija i protokol određuju smer efekta.

Hronično smanjen protok: pamćenje, citohrom oksidaza i krvni sudovi tokom više nedelja

U hroničnim eksperimentima primenjivan je svakodnevni tretman malom dozom tokom više nedelja, a ne jednokratni hitni bolus. U prvoj studiji, pacovi sa trajnom okluzijom karotidnih arterija primali su 4 mg/kg dnevno tokom jednog meseca, posle svake dnevne sesije obuke, kako bi se delovalo na konsolidaciju pamćenja, a ne na trenutni učinak. Životinje sa okluzijom sporije su učile zadatke vizuelnog razlikovanja i imale slabiji učinak na zahtevnom testu pamćenja, dok sposobnost plivanja, motorna aktivnost i prepoznavanje mirisa nisu bili pogođeni. Svakodnevni tretman ublažio je poremećaje učenja i pamćenja bez promene opšte motoričke aktivnosti.

Naknadna studija mapirala je citohrom oksidazu, odnosno mitohondrijski kompleks IV, u 44 moždane regije posle istog jednomesečnog režima. Okluzija je smanjila aktivnost enzima u vizuelnom, prefrontalnom i peririnalnom korteksu, kao i u hipokampusu i amigdali, i oslabila usklađenu aktivnost između vizuelnog korteksa i hipokampusa. Tretman je očuvao regionalnu aktivnost enzima i ojačao te međuregionalne metaboličke korelacije, a očuvana aktivnost bila je povezana sa boljim učinkom na zadacima. Te korelacije opisuju usklađenu aktivnost metaboličkih enzima, a ne direktne mere funkcionalne povezanosti ljudskog mozga, što pregledi energetskog metabolizma mozga pomažu da se jasno razgraniči.

U zasebnoj jednonedeljnoj studiji korišćeno je 2 mg/kg dnevno, uz dodatak inhibitora signalnog puta radi ispitivanja mehanizma. Uz tretman, cerebralni protok krvi porastao je sa oko 60 na oko 100 mL na 100 g u minuti, a gustina krvnih sudova u hipokampusu sa oko 15.1 na 23 procenta. Oba poboljšanja bila su delimično poništena kada je blokiran signalni put preživljavanja PI3K/Akt, a nivo fosforilisanog Akt povećao se uz tretman. Nalazi o protoku krvi, gustini krvnih sudova, barijeri i neuronima ukazuju na neurovaskularnu zaštitu povezanu sa signalizacijom PI3K/Akt, a ne na isključivo metabolički efekat.

Zašto ništa od ovoga nije isto što i hitno zbrinjavanje moždanog udara

Kontrolisani laboratorijski uslovi razlog su što se ovi rezultati ne mogu direktno preneti. Ćelijske kulture nemaju tromb ni farmakokinetiku. Model 2VO predstavlja dugotrajno globalno smanjen protok, a ne iznenadni fokalni embolus sa penumbrom nastalom pre svega nekoliko minuta. Čak i MCAO kod pacova koristi mlade zdrave životinje, anesteziju, ujednačene okluzije i precizno tempirano doziranje, za razliku od starijih pacijenata sa različitim ugrušcima, aterosklerozom, hipertenzijom, dijabetesom i nepoznatim vremenom početka simptoma.

Nijedno objavljeno randomizovano ispitivanje na ljudima nije potvrdilo metilensko plavo kao hitnu terapiju za akutni ishemijski moždani udar. Jedna studija snimanja mozga kod ljudi, koja se ponekad navodi, uključila je 26 zdravih odraslih osoba, a ne pacijente sa moždanim udarom; jedna oralna doza promenila je moždane signale povezane sa zadatkom, uz malo poboljšanje prisećanja. To pokazuje delovanje u centralnom nervnom sistemu, a ne efikasnost kod moždanog udara. Važeće smernice za hitno zbrinjavanje umesto toga usmerene su na brzu reperfuziju intravenskom trombolizom kod pacijenata koji ispunjavaju uslove i trombektomijom kod odgovarajućih okluzija velikih krvnih sudova, a standardni postupci hitnog zbrinjavanja moždanog udara ostaju jedini dokazani pristup. Zbrinjavanje sumnje na moždani udar nikada ne treba odlagati radi primene metilenskog plavog, a praktična ograničenja ekstrapolacije pretkliničkog doziranja objašnjavaju zašto se rasporedi primene kod pacova ne mogu tumačiti kao klinički režimi.

Bezbednosni kontekst dodatno naglašava ovu granicu. Intravensko metilensko plavo nosi upozorenje u crnom okviru o ozbiljnom ili smrtonosnom serotoninskom sindromu kada se kombinuje sa serotonergičkim lekovima, uključujući SSRI, SNRI i MAO inhibitore, koje uzimaju mnogi pacijenti u starosnim grupama u kojima se javlja moždani udar. Kontraindikovano je kod nedostatka G6PD zbog rizika od hemolize. Takođe inhibira signalizaciju azot-monoksida, što u nekim okolnostima povećava vaskularni otpor i pritisak, pa ga ne treba opisivati jednostavno kao lek koji povećava protok krvi u mozgu. Odobreni intravenski režim od 1 mg/kg za stečenu methemoglobinemiju nije režim za moždani udar.

Pošten sažetak je ograničen, ali utemeljen. U periodu oko reperfuzije kod prolazne fokalne ishemije, metilensko plavo u maloj dozi smanjilo je napredovanje lezije kod pacova. Pri trajnoj okluziji odložilo je, ali nije sprečilo infarkt. U astrocitima je štetilo tokom teškog uskraćivanja, a pomagalo pri ponovnoj oksigenaciji. Tokom hronične hipoperfuzije očuvalo je citohrom oksidazu, krvne sudove i pamćenje tokom više nedelja. Jedan prenosilac, tri konteksta, tri odgovora.