Metilensko plavo i hormeza: zašto krive odnosa doze i odgovora mogu da promene smer

Jedan pacov dobije 4 miligrama metilenskog plavog po kilogramu nakon što nauči da prepoznaje predmet i sledećeg dana ga se seća. Drugi pacov dobije 50 i jedva okreće svoj točak za trčanje. Molekul je isti. Smer efekta nije. Svako ko je pročitao više od nekoliko radova o metilenskom plavom naišao je na ovaj preokret, a on ima i naziv: hormeza, dvofazni odgovor u kojem niska i visoka izloženost deluju na isti ishod u suprotnim smerovima.

Taj naziv je koristan samo ako znate šta obećava, a šta ne. Ovaj članak razmatra četiri objavljena skupa podataka o metilenskom plavom, od kojih svaki ima svoj ishod, raspon koncentracija i eksperimentalnu postavku, i pokazuje zašto hemija ove boje čini takve preokrete verovatnim. Završava se upozorenjem koje podaci nameću: kriva koja dostiže vrhunac u jednom eksperimentu opisuje taj eksperiment, a nije metoda za izbor lične doze.

Obrazac ima naziv, a njegovo značenje je uže nego što zvuči

Termin hormeza uveli su 1943. Southam i Ehrlich, a savremeni kvantitativni oblik dali su mu Calabrese i Baldwin: adaptivni dvofazni odgovor, nastao neposredno ili putem kompenzacije nakon narušavanja homeostaze. Obratite pažnju na ono što nedostaje u toj definiciji. Reč korisno se ne pojavljuje. Hormeza govori da kriva menja smer, ništa više.

Oblik koji vidite zavisi od toga koji se ishod nalazi na vertikalnoj osi. Kada je ishod pozitivna funkcija, kao što su aktivnost enzima, potrošnja kiseonika ili rezultat testa pamćenja, stimulacija pri niskoj dozi praćena inhibicijom pri visokoj dozi daje obrnuto U. Kada je ishod nešto nepovoljno, poput učestalosti bolesti, smanjenje pri niskoj dozi praćeno povećanjem pri visokoj dozi daje J ili U. Isti odnos, druga ordinata. Većina istraživanja metilenskog plavog meri pozitivne funkcije, pa ovaj članak govori o krivama oblika obrnutog U, uz razumevanje da je slovo abecede stvar izbora pri prikazivanju podataka.

Pregled iz 2008. koji je objedinio hormetičke odgovore na metilensko plavo daje konkretan uvid u razmere. U ponašanju, fiziologiji i biohemiji, odgovori u zoni stimulacije dostižu približno 130 do 160 procenata kontrolne vrednosti, u proseku oko 140, pre nego što se sa daljim povećanjem doze vrate na kontrolnu vrednost, a zatim padnu ispod nje. Taj raspon je sažetak mnogih eksperimenata, a ne svojstvo molekula. Svaka kriva u nastavku ima sopstveni vrhunac u sopstvenim jedinicama.

Zašto bi baš ovaj molekul mogao da promeni smer delovanja

Metilensko plavo nije jednostavan donor elektrona. Ono je reverzibilni prenosilac. Oksidovani plavi oblik prihvata elektrone i postaje bezbojni redukovani oblik, a redukovani oblik može te elektrone da preda dalje duž lanca. Prenos elektrona koji stoji iza ovih krivih opisan je u prikazu načina na koji metilensko plavo prenosi elektrone, a upravo je ta prenosilačka uloga ovde ključna.

Pri niskim koncentracijama, ovaj ciklus nudi alternativni put ćelijskom disanju. Redukovana boja može da se oksiduje na citohrom-oksidazi, završnom enzimu lanca transporta elektrona, povećavajući brzinu njenog katalitičkog rada zajedno sa potrošnjom kiseonika i respiratornim kapacitetom. Pri višim koncentracijama, ista hemija sa velikim afinitetom prema elektronima počinje da se nadmeće sa normalnim lancem umesto da mu pomaže: preusmerava elektrone sa njihove uobičajene putanje, neposredno troši kiseonik i stvara reaktivne kiseonične vrste umesto da doprinosi proizvodnji energije. Mala količina katalitičkog prenosioca znači veći protok; prekomerna količina konkurentskog primaoca elektrona znači manji. Hemija čini promenu smera verovatnom, ali ne garantuje ništa o tome gde će bilo koji pojedinačni ishod dostići vrhunac.

Nezavisni dokazi o zavisnosti od koncentracije potiču iz ćelija koje uopšte nemaju mitohondrije. U eksperimentima sa eritrocitima iz 1976., niska koncentracija od 1 mikromolara stimulisala je heksoza-monofosfatni put mehanizmom koji je snažno zavisio od oksihemoglobina, dok je pri stostruko višoj koncentraciji od 0.1 milimolara prisustvo oksihemoglobina bilo gotovo nevažno, a vodonik-peroksid je nastajao prema sva tri korišćena testa. Ista boja, dva mehanizma, razdvojena koncentracijom. Eritrociti ne mogu da obavljaju ćelijsko disanje, pa ovo nije mitohondrijska kriva, ali pokazuje da redoks hemija boje menja karakter kako koncentracija raste, što je upravo ono što objašnjenje vezano za mitohondrije zahteva.

Četiri krive, četiri eksperimentalne postavke

Slika u nastavku ponovo prikazuje četiri skupa podataka jedan pored drugog. Svaki panel zadržava sopstvene ose i uslove, jer bi njihovo preklapanje na jednoj skali bilo prva neistina koju bi ovaj članak mogao da iznese. Prikaz je shematski; tačne vrednosti i uslovi navedeni su u tekstu.

Panel A: citohrom-oksidaza u homogenatu mozga pacova. Najjasnija mitohondrijska kriva potiče iz posrednog izvora, prikazana u preglednom radu na osnovu podataka iz homogenata mozga pacova: oko 138 procenata kontrolne aktivnosti pri 0.5 mikromolara, povratak na kontrolnu vrednost oko 5 mikromolara, pad ispod početne vrednosti oko 10 mikromolara, gde autori pretpostavljaju da boja oduzima elektrone uobičajenim kompleksima lanca. Homogenat, mikromolari, spektrofotometrijski test. Ta rečenica obuhvata ceo kontekst i kriva van njega nema značenje.

Panel B: pamćenje pacova i trčanje u točku. U studiji pamćenja kod pacova, efekti pojedinačnih injekcija datih posle učenja testirani su 24 sata kasnije. Pri dozama od 1 do 10 miligrama po kilogramu, lokomotorna aktivnost i hranjenje nisu se razlikovali od onih kod primene fiziološkog rastvora, dok su doze od 50 do 100 miligrama po kilogramu naglo smanjile trčanje u točku (medijana 35 naspram 279 obrtaja), a najviša doza izazvala je nakostrešenost dlake, nekoordinisano kretanje i jedan smrtni ishod. Doza od 4 miligrama po kilogramu poboljšala je habituaciju i prepoznavanje predmeta: tretirani pacovi provodili su gotovo 10 sekundi više uz novi predmet. Potrošnja kiseonika u mozgu porasla je i u homogenatu izloženom niskim mikromolarnim koncentracijama redukovane boje i u mozgovima uzetim 24 sata nakon primene 1 miligrama po kilogramu in vivo. Obratite pažnju na razdvajanje: za ponašanje su korišćene sistemske doze posle učenja, a za potrošnju kiseonika koncentracije u homogenatu i jedna doza in vivo; to su dva eksperimenta, a ne jedna kriva.

Panel C: zebrice u T-lavirintu. U studiji na zebricama, obučene ribe su posle učenja bile potopljene tokom 12 sati u kupke sa nominalnim koncentracijama od 0.1, 0.5, 5.0 ili 10.0 mikromolara, uz kontrolu sa plavom prehrambenom bojom. Grupa na 0.5 mikromolara postigla je najbolji rezultat, grupa na 5.0 odgovarala je kontroli, a grupa na 10.0 imala je lošiji rezultat od grupa sa nižim dozama. Uz ovaj panel idu dve napomene za oprez. Mikromolarna koncentracija u kupki nije mikromolarna koncentracija u krvi ili mozgu; između vode u akvarijumu i tkiva stoje raspodela i nakupljanje. A statistička potpora je slabija nego što oblik sugeriše: visoka doza razlikovala se od grupa sa nižim dozama, dok druge značajne razlike među grupama nisu prijavljene. Kriva je stvarna, ali neprecizna.

Panel D: heksoza-monofosfatni put u eritrocitima. Metz i saradnici uporedili su 1 mikromolar sa 0.1 milimolara u ljudskim eritrocitima pod vazduhom, ugljen-monoksidom i smešom koja je pri fiziološkom pritisku kiseonika dovodila do gotovo potpune zastupljenosti karboksihemoglobina. Stimulacija pri niskoj dozi gotovo je nestala bez oksihemoglobina; stimulacija pri visokoj dozi jedva da se promenila. Peroksid se pojavio samo pri visokoj dozi. Ovaj panel pripada uz ostale kao prikaz hemije, a ne kao četvrta tačka na nekoj jedinstvenoj krivi: nema mitohondrija, razlika u koncentraciji je stostruka, a gasne smeše su eksperimentalno menjane.

Zašto se vrhunci ne podudaraju i ne treba da se podudaraju

Četiri vrhunca nalaze se pri 0.5 mikromolara u homogenatu, pri 4 miligrama po kilogramu ubrizganih posle učenja, pri 0.5 mikromolara u vodi akvarijuma i u paru niske i visoke koncentracije koje se u eritrocitima razlikuju stostruko. Izjednačavanje bilo koje dve od ovih vrednosti predstavlja mešanje različitih kategorija. Svaki ishod ima sopstvenu krivu: optimum za pamćenje ne mora da odgovara optimumu za aktivnost oksidaze, potrošnju kiseonika, lokomotornu aktivnost ili stvaranje peroksida. Svaka jedinica koncentracije znači nešto drugo: mikromolarne koncentracije u homogenatu, nominalne mikromolarne koncentracije u kupki, sistemski miligrami po kilogramu i koncentracije u plazmi, mozgu i mitohondrijama različite su veličine, a sklonost metilenskog plavog da se nakuplja u mitohondrijama i mozgu održava te razlike. Svaki model dodaje sopstvenu farmakokinetiku: vrsta, put primene i vremenski raspored određuju koje tkivo dolazi u kontakt sa kojom količinom boje i koliko dugo.

Ovde je važna i uloga doze i puta primene u bezbednosti metilenskog plavog, jer su efekti visokih doza u ovim radovima — smanjenje motorne aktivnosti, nekoordinisano kretanje, jedan uginuli pacov, stvaranje peroksida — signali toksičnosti u njihovim sopstvenim eksperimentalnim postavkama, a ne granice bezbednosti za bilo koga drugog. A svako ko je u iskušenju da pretvori 4 miligrama po kilogramu kod pacova u režim primene za čoveka treba prvo da pročita kako se nalazi na životinjama odnose prema dokazima kod ljudi: jednostavno preračunavanje miligrama po kilogramu između vrsta nije adekvatno.

Greška koju treba izbeći

Obrnuto U je zavodljivo jer izgleda kao regulator doziranja sa označenom optimalnom tačkom. Ono to nije. Hormeza opisuje šta se dogodilo sa jednim ishodom u jednoj eksperimentalnoj postavci. Spojite četiri takva opisa i dobićete četiri vrhunca u četiri sistema jedinica, što je suprotno regulatoru doziranja. Poštena upotreba ovih krivih služi poređenju i oprezu: očekujte da efekti promene smer sa koncentracijom, očekujte da svaki ishod promeni smer na sopstvenoj tački i ne verujte nijednoj tvrdnji koja pozajmljuje vrhunac jednog eksperimenta da bi opravdala dozu za drugu vrstu, put primene, tkivo ili svrhu. Razlika između eksperimentalnih obrazaca i ličnih odluka o doziranju jeste poenta celog ovog članka, ponovljena još jednom da ne bi promakla.

Kako čitati sledeći rad o odnosu doze i odgovora

Četiri pitanja primenljiva su na gotovo svaku krivu za metilensko plavo na koju ćete naići. Koji ishod je na vertikalnoj osi i da li bi promena njegovog smera dala U ili J? Koju koncentraciju horizontalna osa zapravo prikazuje: nominalnu koncentraciju u kupki, koncentraciju u homogenatu ili plazmi, procenjenu koncentraciju u mozgu ili primenjenu sistemsku dozu? Koji model i vremenski raspored su doveli do nje: homogenat, ćelijska kultura sa uključenim ili isključenim svetlom, obučene životinje kojima je doza data pre ili posle učenja, i kada su testirane? I šta je bila kontrola: fiziološki rastvor, plava prehrambena boja, nosač, i da li statistika u radu podržava svaku tvrdnju zasnovanu na poređenju parova ili samo opšti oblik? Rad koji odgovori na sva četiri pitanja vredan je vašeg vremena. Onaj koji navodi vrhunac bez tih odgovora dao vam je broj bez adrese.