Metilensko plavo i Bartonella: laboratorijski nalazi i ograničenja kliničkih dokaza

Posuda za kulturu i pacijent dele istu reč, infekcija, ali ne i isti pojam. U posudi se infekcija svodi na broj kolonija na agaru. Kod pacijenta ona obuhvata bakterije unutar ćelija i krvnih sudova, lekove koji se kreću kroz krv i tkiva i imunski sistem koji obavlja deo posla. Ako se ta dva konteksta pomešaju, upečatljiv laboratorijski broj počinje da liči na način lečenja. Ako ostanu razdvojeni, isti broj postaje ono što zaista jeste: razlog za sledeći eksperiment.

Upravo je to razdvajanje glavni zadatak ovog pregleda metilenskog plavog i bakterija roda Bartonella. Dve laboratorijske studije jedne istraživačke grupe ispitivale su metilensko plavo protiv bakterije Bartonella henselae u stanjima bez rasta. Obe su pokazale snažnu aktivnost u staklenim i plastičnim posudama. Nijedna nije uključivala ispitivanje na ljudima.

Zašto istraživači ispituju stacionarnu fazu

Većina ispitivanja antibiotika koristi ćelije koje rastu. Taj model izostavlja zahtevniji slučaj: ćelije koje su prestale da se dele i podnose lekove koji ubijaju njihove srodne ćelije u fazi rasta.

Bartonella može da opstaje u organizmu, uključujući unutar eritrocita i endotelnih ćelija. Zato je grupa postavila pitanje koji odobreni lekovi mogu da ubiju B. henselae nakon što uđe u stacionarnu fazu. Niska minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) protiv ćelija koje rastu nije predviđala ubijanje ćelija u stacionarnoj fazi. Rifampicin je imao veoma nizak MIC, ali je slabo ubijao ćelije u stacionarnoj fazi, dok su ih jedinjenja sa višim vrednostima MIC dobro ubijala. Čitaoci koji žele opšti pristup ovakvim radovima pronaći će ga u vodiču za čitanje istraživanja o metilenskom plavom.

Prvo skrining ispitivanje: Li i saradnici, 2019

Skrining ispitivanje stacionarne faze iz 2019. u časopisu Antibiotics koristilo je jedan soj, B. henselae JK53, uzgajan u Schneider podlozi sa 10 posto fetalnog goveđeg seruma, na 37 C uz 5 posto CO2. Jednodnevne kulture uglavnom su činile raspršene ćelije koje se dele. Petodnevne kulture, sa oko 10 na 8. stepen jedinica koje formiraju kolonije po mL, smatrane su kulturama u stacionarnoj fazi i sadržale su vidljive agregate.

Test je koristio SYBR Green I sa propidijum-jodidom, kalibrisan prema mešavinama živih ćelija i ćelija ubijenih izopropanolom. Pošto je metilensko plavo intenzivno obojeno, pozitivni rezultati potvrđivani su mikroskopijom, a zatim brojanjem kolonija na krvnom agaru, što je bio stroži krajnji kriterijum.

Među 1,581 odobrenim lekom ispitanim pri koncentraciji od 50 mikromola po litru, metilensko plavo ostavilo je 16 posto održivih ćelija prema čitaču mikrotitarskih ploča i 25 posto prema mikroskopiji. Daptomicin je dao rezultat od 21 posto, nekoliko azola od 22 do 27 posto, gentamicin 32 posto, eritromicin 66 posto, a ciprofloksacin 74 posto. Pirvinijum-pamoat delovao je snažnije prema čitaču, ali se rezultat nije mogao proceniti mikroskopijom zbog njegove sopstvene fluorescencije.

Protiv B. henselae u fazi rasta, MIC metilenskog plavog bio je od 0.08 do 0.16 mikrograma po mL. Kod petodnevnih ćelija u stacionarnoj fazi, pri koncentraciji od 5 mikrograma po mL, broj kolonija opao je do nivoa na kojem kolonije nisu bile detektovane nakon jednog dana izlaganja, što je odgovaralo rezultatima daptomicina i pirvinijum-pamoata pri njihovim ispitanim koncentracijama. Zasebno ispitivanje ubijanja tokom vremena koristilo je 10 mikrograma po mL. To su nivoi laboratorijske izloženosti, a ne doze, i rad ih tako i navodi. Citirana vršna koncentracija u ljudskoj plazmi od približno 3.9 mikrograma po mL pojavljuje se u radu samo kao dodatni kontekst. Pregled farmakokinetike metilenskog plavog objašnjava zašto se vrednost u plazmi ne može tumačiti kao vrednost u tkivu.

U radu su izričito navedena dva ograničenja. Nije bilo modela biofilma niti ispitivanja kombinacija sa metilenskim plavim. Petodnevni agregati bili su nakupine u tečnoj kulturi u stacionarnoj fazi, a ne validirani eksperiment sa biofilmom. Autori su pozvali na istraživanja na životinjama, ispitivanja kombinacija, rad sa biofilmom i testiranje drugih vrsta roda Bartonella.

Kombinacije i ćelije iz biofilma: Zheng i saradnici, 2020

Naredna studija iz 2020. u časopisu BMC Microbiology zadržala je isti soj i podlogu, ali je prešla na šestodnevne kulture u stacionarnoj fazi i dodala dve stvari koje su nedostajale prvom radu: kombinacije dva leka i model ćelija izdvojenih iz biofilma.

Pri ispitivanju pojedinačnih lekova na istoj koncentraciji od 5 mikrograma po mL tokom 24 sata, posle metilenskog plavog ostalo je 3.2 puta 10 na 4. stepen jedinica koje formiraju kolonije po mL, naspram približno 2.8 puta 10 na 10. stepen u kontroli. Ciprofloksacin, gentamicin i nitrofurantoin ostavili su manje kolonija u istoj vremenskoj tački. To se razlikuje od rezultata iz 2019, kada pri istoj nominalnoj koncentraciji nakon jednog dana nije bilo detektovanih kolonija. Starost kulture, gustina i postupci rukovanja razlikovali su se, pa je efekat ubijanja bio ponovljiv po smeru, ali ne i identičan po obimu. Ova razlika između ponovljenih eksperimenata jedan je od razloga zašto se pri standardnim proverama bezbednosti i interakcija laboratorijska aktivnost posmatra odvojeno od kliničkog efekta.

Skrining kombinacija najčešće je citiran deo rada. Svaka komponenta bila je na fiksnoj koncentraciji od 5 mikrograma po mL. I azitromicin sa metilenskim plavim i rifampicin sa metilenskim plavim dali su rezultat bez detektovanih kolonija u stacionarnoj fazi nakon 24 sata, kao i obe kombinacije sa ciprofloksacinom. Među 25 ispitanih parova, samo su ta četiri dala takav rezultat. Nije sprovedena formalna analiza sinergije, pa je ispravan izraz aktivna kombinacija u tim uslovima, a ne dokazana sinergija.

Eksperiment sa biofilmom ispitivao je ćelije izdvojene iz mladog, razorenog biofilma, a ne prodiranje u netaknut zreo biofilm. Kulture su uzgajane pet dana, razređene i prenete u ploče sa bunarčićima na još pet dana, potvrđene bojenjem kristal-violetom, a zatim sastrugane pre izlaganja lekovima. Pri koncentraciji od 5 mikrograma po mL, metilensko plavo samo smanjilo je broj na 2.3 puta 10 na 2. stepen do 6. dana, što je bilo među najboljim rezultatima pojedinačnih lekova, ali nije bilo nula. Obe kombinacije sa metilenskim plavim dostigle su nulu do 6. dana, kao i obe kombinacije sa ciprofloksacinom.

Autori su istakli ista ograničenja koja bi uočio pažljiv čitalac: mlad, sastrugan biofilm umesto starog, netaknutog biofilma; jedna praktično odabrana koncentracija za sve lekove umesto realne vršne koncentracije za svaki lek; samo odabrani parovi zasnovani na azitromicinu ili rifampicinu; jedan soj; bez životinja; bez pacijenata. Kasnija istraživanja sa tri leka bila su predložena, ali rezultati nisu prijavljeni.

Poređenje dizajna studija

Tabela sažeto prikazuje suštinu ovog članka. Sve levo od poslednje kolone predstavlja rad sa kulturama. Ništa iz bilo kog od ova dva rada ne pripada poslednjoj koloni.

Bartonella nije Borrelia

Oba rada pominju Borrelia burgdorferi, spirohetu koja izaziva Lajmsku bolest, zato što je test sa bojama potekao iz ranijih istraživanja stacionarne faze bakterije Borrelia u istoj laboratoriji, u kojima su metilensko plavo i daptomicin takođe pokazali aktivnost. Taj istorijat je koristan kontekst i čest izvor grešaka.

Nijedan eksperiment u ova dva rada o bakteriji Bartonella ne ispituje uporedo bakterije Borrelia i Bartonella. Organizmi se razlikuju, podloge se razlikuju, koncentracije se razlikuju, a pretpostavljeni efekat metilenskog plavog na membranu bakterije Bartonella naveden je kao spekulacija koja zahteva dodatna istraživanja. Rezultate ne treba prenositi sa jedne vrste na drugu, a nijedan rad ne podržava široke tvrdnje o parazitima. Poređenje perzistentnih ćelija bakterija Borrelia i Bartonella upravo iz tog razloga razdvaja ove dve grupe istraživanja.

Zašto rezultati iz kultura ne postaju protokol

Razumljivo je interesovanje za pretragu protokola za metilensko plavo i bakteriju Bartonella. Ovi radovi pokazuju zašto taj izraz treba shvatiti kao znak upozorenja, a ne kao spisak za kupovinu.

Prvo, 5 mikrograma po mL u bunarčiću nije recept. Uz tu vrednost ne idu podaci o apsorpciji, distribuciji, vezivanju za proteine, prodiranju u ćelije ili podnošljivosti. Autori su je odabrali kao grub prosek vršnih koncentracija antibiotika i naveli da buduća istraživanja treba da koriste realnu koncentraciju za svaki pojedinačni lek.

Drugo, nula kolonija znači da nema kolonija u tim uslovima zasejavanja, a ne da je tkivo sterilno. Perzistentne ćelije, unutarćelijske bakterije i ograničenja uzorkovanja ostaju van agarne ploče.

Treće, kombinacije koje sterilišu bunarčić mogu u organizmu da budu neuspešne ili štetne. Azitromicin sa metilenskim plavim i rifampicin sa metilenskim plavim jesu laboratorijski parovi pri laboratorijskim nivoima izloženosti. Bez farmakokinetičkih podataka sa životinja i kontrolisanih podataka sa ljudi nema utvrđene doze, trajanja niti odnosa koristi i rizika. Svako ko razmatra mogućnosti treba da razgovara sa lekarom i prouči kada upotreba metilenskog plavog zahteva medicinski nadzor pre nego što izvede bilo kakav zaključak iz podataka dobijenih u posudi.

Uski zaključak koji ovi radovi zaista podržavaju glasi: metilensko plavo ima ponovljivu aktivnost protiv B. henselae JK53 koja ne raste, u uslovima in vitro, uključujući laboratorijske kombinacije dva leka, pri čemu najjači rezultati za kombinacije i ćelije iz biofilma potiču iz studije iz 2020. Sve ostalo, uključujući pitanje da li ta aktivnost ima značaja za bartonelozu kod ljudi, ostaje neispitano.