EMB agar naspram MacConkey agara: izbor i tumačenje podloga

Student zasejava isti uzorak vode na dve ploče. Na jednoj se pojavljuju tamne kolonije sa zelenim metalnim sjajem. Na drugoj se pojavljuju jarkoružičaste kolonije sa zamućenim oreolom. Obe ploče su inokulisane iz iste epruvete, inkubirane jedna pored druge i očitane u istom trenutku. Student pita koja je ploča ispravna.

Obe ploče su ispravne. One odgovaraju na različita pitanja. Zabuna nastaje kada se ove dve podloge tretiraju kao međusobno zamenljivi skrininzi za crevne bakterije. Njihova zajednička svrha jeste selekcija Gram-negativnih enteričnih organizama i razlikovanje fermentatora laktoze od nefermentatora, ali tu svrhu ostvaruju različitom hemijom i različitom vizuelnom logikom. Kada razumete ta dva osnovna koncepta, izbor podloge i očitavanje kolonija postaju rutinski.

Kratak odgovor

EMB agar koristi dve boje, eozin Y i metilensko plavo, koje imaju dvostruku ulogu: suzbijaju rast Gram-pozitivnih organizama i talože se oko snažnih proizvođača kiseline, stvarajući tamne kolonije, klasično sa metalnozelenim sjajem kod Escherichia coli. MacConkey agar razdvaja te funkcije: žučne soli i kristal-violet suzbijaju Gram-pozitivne organizme, laktoza omogućava fermentaciju, a neutralno crveno pokazuje stvaranje kiseline kroz ružičaste ili crvene kolonije. Ako je cilj upečatljiva presumptivna demonstracija E. coli, EMB ima svoje mesto. Ako je cilj jasno razdvajanje ružičastih od bezbojnih kolonija, odnosno fermentatora laktoze od nefermentatora, naročito u postupcima sa stolicom ili urinom, MacConkey se obično lakše očitava. Nijedna ploča ne identifikuje organizam samo na osnovu boje.

EMB: boje koje istovremeno selektuju i pokazuju reakciju

Koncept EMB-a objedinjuje selekciju i indikaciju u istim molekulima. ASM protokol za agar sa eozinom i metilenskim plavim opisuje EMB kao selektivnu i diferencijalnu podlogu, pri čemu par boja inhibira mnoge Gram-pozitivne organizme, dok fermentacija laktoze podstiče vezivanje i taloženje boja. Standardna Levine formulacija sadrži pepton, laktozu, fosfat, eozin Y, metilensko plavo i agar, kako je navedeno u FDA BAM metodi za Levine EMB agar. Imajte na umu da su starije EMB recepture ponekad sadržale saharozu zajedno sa laktozom, dok Levine EMB sadrži laktozu bez saharoze, pa zabeležite koju formulaciju vaša laboratorija koristi.

Očitavanje EMB-a znači praćenje ponašanja boja. Intenzivna fermentacija laktoze proizvodi dovoljno kiseline da izazove obilno taloženje boja, dajući kolonijama E. coli tamnoplavo-crne centre i, u klasičnom slučaju, metalnozeleni sjaj pri reflektovanoj svetlosti. Slabiji fermentatori, kao što su Enterobacter i Klebsiella, obično rastu kao ružičaste do ljubičaste mukoidne kolonije bez tog sjaja. Nefermentatori, kao što su Salmonella, Shigella i Proteus, uglavnom rastu kao bezbojne ili prozirne kolonije zato što ne proizvode nagli porast kiselosti koji dovodi do taloženja boja. Gram-pozitivni organizmi su obično suzbijeni, mada je stepen supresije promenljiv i zavisi od soja i proizvoda. Detaljna hemija pripreme boja, uključujući razlog zbog kojeg se metilensko plavo ponaša kao katjonska boja, pripada posebnoj raspravi o formulacijama boja, dok je širi mikroskopski kontekst prikazan u atlasu metoda bojenja. Ovaj članak ostaje usmeren na izbor podloge i njeno očitavanje.

Gornja slika je ilustrativna. Prikazuje očekivanu vizuelnu logiku: tamne kolonije sa sjajem, ružičaste mukoidne tipove i blede tipove na EMB-u, nasuprot ružičastim i bledim tipovima na MacConkey podlozi. Koristite je za učenje obrasca, a zatim svako očitavanje potvrdite pomoću fotografisanih kontrola i uputstva za tačnu podlogu koju koristite na radnom mestu.

MacConkey: odvojene funkcije, jednostavnije vizuelno pravilo

Koncept MacConkey podloge svaku funkciju dodeljuje posebnom sastojku. ASM protokol za MacConkey agar koristi isti okvir selektivne i diferencijalne podloge, a FDA BAM metoda za MacConkey agar navodi funkcionalne sastojke: peptone, laktozu, žučne soli, so, neutralno crveno, kristal-violet i agar. Žučne soli zajedno sa kristal-violetom selektuju protiv Gram-pozitivnih organizama. Laktoza predstavlja supstrat za fermentaciju. Neutralno crveno služi kao indikator pH, prelazeći u ružičastu do crvenu boju tamo gde se stvara kiselina, ponekad uz taloženje žuči oko snažnih fermentatora.

Pravilo očitavanja je namerno jednostavno: ružičasta boja znači fermentator laktoze, dok bezbojna ili bleda kolonija znači nefermentator. E. coli je ružičasta do crvena, često sa oreolom taloga žuči. Klebsiella i Enterobacter su ružičasti i često mukoidni zbog svojih kapsula. Salmonella, Shigella, Proteus i mnogi drugi Gram-negativni štapići izgledaju bezbojno. Jedna dodatna prednost važna je u nastavnim laboratorijama: žučne soli uglavnom smanjuju rojenje Proteus-a, pa se izolovane kolonije lakše dobijaju na MacConkey podlozi nego na neselektivnim podlogama, iako supresija nije potpuna i postoje alternative bez soli kada je kontrola rojenja prioritet.

Molekularni razlog za ovakvo ponašanje boja povezan je sa naelektrisanjem i strukturom. Metilensko plavo je katjonska fenotiazinska boja čije struktura i svojstva objašnjavaju njen afinitet prema kiselim bakterijskim površinama, a isti afinitet deluje kada se boja taloži u kiselim zonama na EMB-u.

Poređenje na prvi pogled

Tabelu čitajte kao postupak odlučivanja. Kada vežba zahteva da studenti vide gradijent jačine fermentacije sa jednim upečatljivim krajnjim rezultatom, EMB to pokazuje. Kada je potreban brz binarni pregled pre biohemijske potvrde, MacConkey to omogućava.

Koja podloga za koji uzorak

Za vežbe sa vodom usmerene na presumptivno prepoznavanje fekalnih koliforma ili E. coli, EMB je privlačan zato što je sjaj vizuelno karakterističan. MacConkey takođe omogućava rad sa enteričnim Gram-negativnim organizmima i istorijski se koristio za analizu vode, ali nijedna od ove dve podloge ne zamenjuje regulatornu metodu za ispitivanje vode, koja može zahtevati podloge kao što su modifikovani mTEC ili MI, u zavisnosti od testa. Proverite metodu koju je vaša laboratorija obavezna da prati.

Za razdvajanje fermentatora od nefermentatora u uzorcima poput stolice, MacConkey je generalno korisniji od ove dve podloge. Praktičan rad sa stolicom radi izdvajanja Salmonella ili Shigella obično uključuje dodatne, selektivnije enterične podloge kao što su XLD ili Hektoen enteric, umesto oslanjanja samo na MacConkey.

Za nastavne vežbe sa urinom koje oponašaju klinički radni tok, kombinujte MacConkey sa krvnim agarom. MacConkey omogućava početno razdvajanje Gram-negativnih organizama, dok krvni agar omogućava rast organizama koje MacConkey suzbija. Ova kombinacija je standardna u kliničkim opisima postavljanja urinokulture.

Za čisto konceptualnu nastavu koristite obe podloge. EMB pokazuje da je intenzitet fermentacije važan i da jedan molekul može imati dve uloge. MacConkey pokazuje modularni dizajn: selektor, supstrat i indikator ostaju odvojeni. Studenti koji zaseju poznatu E. coli, poznatu Klebsiella aerogenes i poznatu Salmonella jednu pored druge na obe podloge retko ponovo pomešaju ova dva koncepta.

Zamke pri očitavanju koje se ponavljaju svakog semestra

Najčešća greška je identifikacija samo na osnovu boje. Ružičasta kolonija na MacConkey podlozi može biti E. coli, Klebsiella, Enterobacter ili drugi fermentator. Bezbojna kolonija može biti Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas ili drugi nefermentator. Boja je skrining fenotip koji usmerava dalji potvrdni rad, kao što su bojenje po Gramu, oksidazni test, biohemijski paneli ili instrumentalna identifikacija, a ne naziv vrste.

Druga greška je preveliko oslanjanje na odsustvo sjaja. Neke stvarne kolonije E. coli, naročito izolovane, stvaraju malo ili nimalo metalnog sjaja na EMB-u. Odsustvo sjaja ne isključuje E. coli, a prisustvo sjaja je ne dokazuje. Sjaj tretirajte kao presumptivni pokazatelj.

Treća greška je poređenje ploča različite starosti. Odloženi fermentatori laktoze mogu postati ružičasti na MacConkey podlozi nakon produžene inkubacije, što zamagljuje jasno razdvajanje fermentatora od nefermentatora. Očitavajte u vremenu koje je laboratorija odredila i uz rezultat zabeležite trajanje inkubacije.

Četvrta greška je tumačenje mešovitog rasta kao jednog organizma. Ružičasta kolonija pored bezbojne kolonije predstavlja dva fenotipa, a ne jedan međutip. Birajte dobro izolovane kolonije i svaki morfotip obrađujte zasebno. Mukoidna tekstura stvara sličnu zamku: i Klebsiella i Enterobacter mogu izgledati mukoidno, pa sama kapsula nikada nije dovoljna za određivanje naziva. Organizam koji se ranije u nastavi nazivao Enterobacter aerogenes sada je klasifikovan kao Klebsiella aerogenes, što objašnjava zašto se starije tabele i novije oznake naizgled ne slažu.

Kontrole i završno pravilo

U svakoj sesiji koristite fotografisane ili sveže kontrole: E. coli za reakciju snažnog fermentatora, Klebsiella aerogenes za mukoidnu fermentaciju bez klasičnog sjaja, soj Salmonella za bezbojnu reakciju nefermentatora i Staphylococcus aureus za potvrdu supresije Gram-pozitivnih organizama na vašem konkretnom proizvodu. Brojeve sojeva i kriterijume prihvatljivosti uskladite sa uputstvom proizvođača, jer se selektivnost menja sa sadržajem žuči, kristal-violeta i boja.

Zapamtite jednu rečenicu za rad za laboratorijskim stolom. EMB koristi boje koje istovremeno selektuju i pokazuju reakciju, što daje upečatljiv signal E. coli po cenu suptilnijeg očitavanja. MacConkey razdvaja selekciju od indikacije, što daje jednostavno razdvajanje ružičastih i bledih kolonija po cenu manje detalja o fermentaciji. Izaberite podlogu čiji koncept odgovara pitanju, potvrdite boju odgovarajućim testovima i dve ploče prestaju da se nadmeću i počinju da se dopunjuju.