Spektri i përthithjes së blusë së metilenit dhe absorptiviteti molar: një referencë me kushte të përcaktuara

Spektri i blusë së metilenit duket i thjeshtë derisa përpiqeni të ripërdorni një vlerë prej tij. Një laborator raporton një koeficient molar të ekstinksionit pranë 82,000. Një tjetër raporton 67,000. Një i tretë raporton mbi 100,000. Të tria mund të jenë përshkrime të sakta të matjeve të tyre, por asnjëra nuk është një konstante universale për ngjyruesin.

Paqartësia vjen nga përzierja e dy koncepteve të ndryshme. Absorbanca është një matje e kryer mbi një tretësirë të caktuar në një kuvetë të caktuar. Absorptiviteti molar, që shpesh shënohet si epsilon, është një parametër në një model të asaj tretësire. Kur bluja e metilenit ndryshon gjendjen e asociimit, ndryshon modeli, prandaj ndryshon edhe parametri. Një praktikë e dobishme është që çdo koeficient të trajtohet si një vlerë e shoqëruar me kushtet përkatëse: gjatësia valore, tretësi, pH-ja ose buferi, temperatura, intervali i përqendrimit dhe gjatësia e rrugës optike duhet të shoqërojnë numrin.

Brezi i monomerit në tretësira ujore të holluara

Në tretësirë ujore të holluar, brezi mbizotërues i kationit të blusë së metilenit ndodhet pranë 664 deri në 665 nm; zakonisht raportohet brenda 664 deri në 668 nm, në varësi të instrumenteve dhe zgjedhjeve të kalibrimit. Ky brez është zgjedhja e duhur për përcaktim sasior kur tretësira është aq e holluar sa pjesa më e madhe e ngjyruesit është në formë monomerike.

Tri vlera nga literatura tregojnë pse kushtet kanë më shumë rëndësi sesa numri i paraqitur në plan të parë. Studiuesit e argjilave, të cilët i mbajtën mostrat ujore nën rreth 7 micromolar në kuveta 1 cm, raportuan një epsilon prej rreth 82,000 M-1 cm-1 në 665 nm. Kjo vlerë është veçanërisht e dokumentuar mirë si pjerrësi empirike kalibrimi për mostra ujore shumë të holluara. Një kalibrim parësor i mëvonshëm në ujë të dejonizuar, që përdori 2.34 deri në 37.52 micromolar dhe një rrugë optike 1 cm, dha rreth 67,100 M-1 cm-1 në 665 nm për ngjyruesin total. Rezultati më i ulët është i pritshëm, jo kontradiktor, sepse gjysma e sipërme e atij intervali kalibrimi përmban tashmë një sasi të konsiderueshme dimeri. Një vlerë e tretë, rreth 73,460 M-1 cm-1 në 664 nm, vjen nga një studim në pH 6.86 dhe 293 K që e ndau spektrin e vëzhguar në pjesë monomeri dhe dimeri, siç përmblidhet në një rishikim kritik të kohëve të fundit mbi fotofizikën e blusë së metilenit. Ky numër përfaqëson një komponent monomerik të nxjerrë me dekonvolucion, jo një pjerrësi të drejtpërdrejtë të absorbancës kundrejt ngjyruesit total.

Përfundimi praktik: zgjidhni koeficientin, kushtet e të cilit përputhen me mostrat tuaja, ose kryeni kalibrimin tuaj. Mos përdorni 82,000 në një analizë me bufer fosfat në 30 micromolar duke supozuar se lineariteti vazhdon të vlejë.

Shpatulla në gjatësi valore më të shkurtra është një përzierje

Me rritjen e përqendrimit, një shpatull pranë 600 deri në 615 nm rritet në raport me maksimumin në 664 nm. Studimet moderne zakonisht e vendosin kontributin e dimerit të tipit H pranë 605 deri në 610 nm. Analiza globale spektrale e blusë së metilenit në ujë dallon një maksimum të dimerit në 607 nm dhe një maksimum të agregatit të rendit më të lartë në 600 nm, me komponentë rezonance të monomerit në 664 dhe 650 nm. Teksti i plotë është i disponueshëm përmes regjistrimit me qasje të hapur për PMID 33251415.

Kjo shpatull nuk duhet të emërtohet si absorbancë vetëm e dimerit. Struktura vibronike e monomerit kontribuon gjithashtu në të njëjtën zonë, prandaj lartësia e matur është një mbivendosje. Një përshtatje globale tregoi se një model me monomer dhe dimer nuk funksiononte në të gjithë intervalin nga 1.1 micromolar deri në 3.4 millimolar, ndërsa shtimi i një tetrameri dha përshtatjen më të mirë, me sinjalin e tetramerit tashmë të dallueshëm nën 34 micromolar. Intensitetet e komponentëve të nxjerrë nga përshtatja ishin të larta: rreth 107,800 M-1 cm-1 në 664 nm për komponentin kryesor të monomerit, rreth 101,400 për dimerin në 607 nm dhe rreth 138,500 për tetramerin në 600 nm, në ujë të dejonizuar pa bufer, me klorur natriumi nga 0 deri në 0.15 M dhe temperatura nga 282 deri në 333 K. Këto janë pjesë të veçuara përmes modelit, prandaj nuk duhet të përdoren në vend të një pjerrësie empirike të ligjit Beer Lambert.

Prirja për dimerizim është përcaktuar drejtpërdrejt në mënyrë sasiore. Në pH 6.86 dhe 293 K, një studim përftoi një konstante dimerizimi pranë 3,900 M-1. Kjo madhësi shpjegon pse një tretësirë pune 5 micromolar sillet pothuajse në mënyrë lineare, ndërsa një tretësirë stok 50 micromolar jo. Një kontroll i dobishëm gjatë zhvillimit të metodës është raporti i absorbancës pranë 610 nm ndaj absorbancës pranë 665 nm. Kur ky raport rritet me përqendrimin, epsilon në 664 nm nuk përshkruan më një specie të vetme të pandryshueshme.

Në një interval përqendrimi ku mbizotëron një çift speciesh që shndërrohen në njëra-tjetrën, spektrat mund të kenë një pikë izosbestike të përbashkët, e vëzhguar eksperimentalisht pranë 625 nm në seri ujore. Një pikë e qartë dhe e qëndrueshme përputhet me praninë e dy specieve mbizotëruese. Kur pika zhvendoset ose zhduket me rritjen e përqendrimit, trajtojeni si paralajmërim se janë përfshirë agregate të rendit më të lartë ose ekuilibra që ndryshojnë, jo si gabim të instrumentit.

Tretësi, pH-ja dhe temperatura e zhvendosin spektrin

Uji favorizon asociimin. Shtimi i dimetil sulfoksidit pengon dimerizimin, i zhvendos maksimumet e përthithjes dhe të fluoreshencës drejt gjatësive valore më të mëdha dhe e rrit rendimentin kuantik të fluoreshencës rreth katërfish, sipas studimit të tretësit për blunë e metilenit në ujë dhe përzierje me DMSO, të indeksuar si PMID 30933781. Ky studim i trajton spektrat ujorë si një ekuilibër monomer–dimer, me absorbancën e monomerit pranë 650 deri në 670 nm dhe absorbancën e dimerit pranë 580 deri në 615 nm, dhe nxjerr konstantet e dimerizimit nga spektrat në 293.15 K.

Alkoolet ndryshojnë si pozicionin, ashtu edhe intensitetin e dukshëm, por nuk e eliminojnë agregimin. Në një krahasim parësor në 31.3 micromolar dhe temperaturë dhome, të raportuar në një studim të tretësit për blunë e metilenit, maksimumi në gjatësi valore të mëdha ishte 665 nm në ujë, por 655 nm në metanol, me vlera të dukshme për tretësirën e plotë pranë 37,100 në ujë dhe 60,800 në metanol. Një validim i veçantë në etanol absolut në 298 K dha një maksimum në 655 nm me epsilon pranë 68,000.

Ndryshimet e zakonshme të pH-së e zhvendosin spektrin më pak sesa supozojnë shumë protokolle. Rishikimi kritik i cituar më sipër raporton se nga rreth pH 2 deri në pH 12, maksimumi mbeti pranë 665 nm, me vetëm ndryshime të vogla të intensitetit deri në pH 11. Lloji i buferit dhe forca jonike mund t'i ndryshojnë rezultatet po aq sa pH-ja nominale, prandaj regjistroni buferin dhe kripën konkrete, jo vetëm leximin e pH-metrit. Acidi i fortë ose baza e fortë përbëjnë një rast më vete, sepse ngjyruesi mund të pësojë ndryshim kimik dhe jo asociim të kthyeshëm. Temperatura dhe kripa gjithashtu e zhvendosin ekuilibrin, prandaj studimi i vitit 2020 në ujë i ndryshoi qëllimisht të dyja.

Matja në mënyrë që vlera të mbetet e vlefshme

Puna sasiore mbështetet në marrëdhënien Beer Lambert, sipas së cilës absorbanca është e barabartë me epsilon shumëzuar me përqendrimin dhe me gjatësinë e rrugës optike, si edhe në vërtetimin se intervali linear është realisht i vlefshëm në kushtet tuaja.

Përdorni një kuvetë 1 cm për punë me përqendrime të ulëta micromolar. Me epsilon pranë 82,000, 5 micromolar jep absorbancë pranë 0.41 dhe 10 micromolar jep rreth 0.82. Për matje të përqendruara te monomeri në ujë pa shtesa, qëndrimi pranë ose nën afërsisht 5 deri në 7 micromolar është më i sigurt sesa kalibrimi deri thellë në intervalin e dhjetëra micromolar. Për tretësira stok të përqendruara, shkurtoni rrugën optike në vend që të pranoni absorbancë shumë mbi 1.

Përdorni si blank një matricë identike: të njëjtën cilësi uji, të njëjtin fraksion bashkëtretësi, të njëjtin bufer dhe të njëjtat kripëra, por pa ngjyrues. Përgatitni standardet e kalibrimit në të njëjtën matricë dhe në të njëjtën temperaturë. Gjatë zhvillimit, skanoni të gjithë diapazonin e dukshëm, idealisht rreth 550 deri në 750 nm, në vend që të lexoni vetëm një gjatësi valore. Ndiqni formën, jo vetëm lartësinë. Nëse hollimi në seri ndryshon formën e normalizuar, sistemi varet kimikisht nga përqendrimi. Një maksimum i qëndrueshëm dhe një raport i qëndrueshëm i absorbancës në 610 ndaj asaj në 665 nm janë prova më të forta për një interval të pranueshëm sesa vetëm një R në katror i lartë.

Dokumentoni formën e reagentit. Materiali tregtar mund të jetë klorur metiltionini anhidër ose një hidrat, si trihidrati, prandaj masa molare e përdorur për llogaritjet e tretësirës stok duhet të përputhet me materialin në shishe. Vetëm ky hap shpjegon një pjesë të mospërputhjeve mes përqendrimeve molare nominale në laboratorë të ndryshëm. E njëjta disiplinë vlen kur rezultatet përdoren në llogaritjet e analizave sasiore, kur spektrat mbështesin kontrollet e qëndrueshmërisë së formulimit dhe kur profilet e papastërtive kërkojnë shqyrtimin e pastërtisë dhe të specifikimeve.

Përmbledhje me kushte të përcaktuara

Përdoreni këtë tabelë si model fillestar për një regjistër laboratorik, jo si burim konstantesh të këmbyeshme.

Gjatësia valore e absorbancës së blusë së metilenit është, pra, një përgjigje e shkurtër me një shënim të gjatë sqarues. Raportoni maksimumin që matët, në tretësirën që matët, në përqendrimin që matët. Kjo praktikë pengon që një vlerë pranë 664 nm në tretësirë ujore të holluar të kthehet në një konstante universale të rreme.