Bluja e metilenit dhe Bartonella: gjetjet laboratorike dhe kufijtë e provave klinike

Një enë kultivimi dhe një pacient kanë të përbashkët një fjalë, infeksion, por jo të njëjtin koncept. Në enë, infeksioni është një numër kolonish në agar. Te pacienti, ai përfshin baktere brenda qelizave dhe enëve të gjakut, barna që qarkullojnë në gjak dhe inde, si dhe një sistem imunitar që kryen një pjesë të punës. Nëse i ngatërroni këto dy raste, një shifër mbresëlënëse laboratorike fillon të duket si një trajtim. Nëse i mbani të ndara, e njëjta shifër mbetet ajo që është: një arsye për të kryer eksperimentin e radhës.

Ruajtja e këtij dallimi është qëllimi kryesor i këtij shqyrtimi mbi blunë e metilenit dhe Bartonella. Dy studime laboratorike nga i njëjti grup kërkimor testuan blunë e metilenit kundër Bartonella henselae në gjendje pa rritje. Të dyja raportuan aktivitet të fortë në enë qelqi dhe plastike. Asnjëri nuk e testoi te një njeri.

Pse studiuesit testojnë fazën stacionare

Shumica e testimeve të antibiotikëve përdorin qeliza në rritje. Ky model lë jashtë një rast më të vështirë: qelizat që kanë ndaluar së ndari dhe tolerojnë barna që vrasin qelizat e të njëjtit lloj që vazhdojnë të rriten.

Bartonella mund të qëndrojë në trup, përfshirë brenda eritrociteve dhe qelizave endoteliale. Prandaj grupi shtroi pyetjen se cilat barna të miratuara mund ta vrasin B. henselae pasi ajo të ketë hyrë në fazën stacionare. Një MIC e ulët kundër qelizave në rritje nuk parashikonte vrasjen e qelizave në fazën stacionare. Rifampicina kishte një MIC shumë të ulët, por i vriste dobët qelizat stacionare, ndërsa përbërje me vlera më të larta të MIC i vrisnin mirë. Lexuesit që dëshirojnë një metodë të përgjithshme për këtë lloj artikulli shkencor do ta gjejnë në udhëzuesin për leximin e kërkimeve mbi blunë e metilenit.

Testimi i parë përzgjedhës: Li dhe kolegët, 2019

Testimi përzgjedhës i fazës stacionare i vitit 2019 në Antibiotics përdori një shtam të vetëm, B. henselae JK53, të kultivuar në mjedisin Schneider me 10 për qind serum fetal gjedhi në 37 C me 5 për qind CO2. Kulturat njëditore përbëheshin kryesisht nga qeliza të shpërndara që ndaheshin. Kulturat pesëditore, me rreth 10 në fuqinë e 8-të njësi formuese kolonish për mL, u konsideruan në fazën stacionare dhe përmbanin agregate të dukshme.

Analiza përdori SYBR Green I me jodur propidiumi, të kalibruar kundrejt përzierjeve të qelizave të gjalla dhe qelizave të vrara me izopropanol. Meqë bluja e metilenit ka ngjyrë të fortë, rezultatet pozitive u konfirmuan me mikroskopi dhe më pas me numërimin e kolonive në agar me gjak, kriteri përfundimtar më i rreptë.

Nga 1,581 barna të miratuara të testuara në 50 mikromolar, bluja e metilenit la 16 për qind qëndrueshmëri jetësore sipas lexuesit të pllakave dhe 25 për qind sipas mikroskopisë. Daptomicina dha 21 për qind, disa azole dhanë 22 deri në 27 për qind, gentamicina 32 për qind, eritromicina 66 për qind dhe ciprofloksacina 74 për qind. Pamoati i pirviniumit u duk më i fuqishëm sipas lexuesit, por nuk mund të vlerësohej me mikroskopi për shkak të fluoreshencës së vet.

Kundër B. henselae në rritje, MIC e blusë së metilenit ishte 0.08 deri në 0.16 mikrogramë për mL. Kundër qelizave stacionare pesëditore, në 5 mikrogramë për mL, numri i kolonive ra deri në mungesë kolonish të zbulueshme pas një dite ekspozimi, duke barazuar rezultatin e daptomicinës dhe të pamoatit të pirviniumit në përqendrimet e testuara për to. Një test i veçantë i vrasjes në varësi të kohës përdori 10 mikrogramë për mL. Këto janë nivele ekspozimi laboratorik, jo doza, dhe artikulli i paraqet si të tilla. Një vlerë kulmore plazmatike te njerëzit, e cituar si afër 3.9 mikrogramë për mL, shfaqet në artikull vetëm si kontekst. Përmbledhja e farmakokinetikës së blusë së metilenit shpjegon pse një vlerë plazmatike nuk mund të interpretohet si një vlerë në inde.

Dy kufizime shprehen qartë në artikull. Nuk kishte model biofilmi dhe nuk kishte testim të kombinimeve me blunë e metilenit. Agregatet pesëditore ishin grumbullime në një kulturë të lëngshme në fazën stacionare, jo një eksperiment i validuar me biofilm. Autorët kërkuan studime në kafshë, studime me kombinime, studime me biofilm dhe testime në specie të tjera të Bartonella.

Kombinimet dhe qelizat e marra nga biofilmi: Zheng dhe kolegët, 2020

Studimi vijues i vitit 2020 në BMC Microbiology ruajti të njëjtin shtam dhe mjedis kultivimi, por kaloi te kulturat stacionare gjashtëditore dhe shtoi dy elemente që mungonin në artikullin e parë: kombinime me dy barna dhe një model me qeliza të marra nga biofilmi.

Për barnat e përdorura veçmas, në një përqendrim të njëjtë prej 5 mikrogramësh për mL për 24 orë, bluja e metilenit la 3.2 herë 10 në fuqinë e 4-të njësi formuese kolonish për mL, kundrejt një kontrolli afër 2.8 herë 10 në fuqinë e 10-të. Ciprofloksacina, gentamicina dhe nitrofurantoina lanë më pak koloni në të njëjtën pikë kohore. Kjo ndryshon nga rezultati i vitit 2019, ku i njëjti nivel nominal nuk la koloni të zbulueshme pas një dite. Mosha e kulturës, dendësia dhe mënyra e trajtimit të saj ndryshonin, ndaj efekti vrasës ishte i riprodhueshëm në drejtim, por jo i njëjtë në madhësi. Ky ndryshim nga një test në tjetrin është një nga arsyet pse kontrollet standarde të sigurisë dhe ndërveprimeve e trajtojnë fuqinë laboratorike veçmas nga efekti klinik.

Testimi përzgjedhës i kombinimeve është pjesa më e cituar. Çdo përbërës u mbajt në 5 mikrogramë për mL. Si azitromicina plus bluja e metilenit, ashtu edhe rifampicina plus bluja e metilenit, nuk dhanë koloni të zbulueshme të fazës stacionare në 24 orë; po kështu edhe të dyja çiftet me ciprofloksacinë. Vetëm këto katër nga 25 çiftet e testuara e dhanë këtë rezultat. Nuk u krye analizë formale e sinergjisë, ndaj termi i saktë është kombinim aktiv në këto kushte, jo sinergji e provuar.

Eksperimenti me biofilm testoi qeliza të marra nga një biofilm i ri i shpërbërë, jo depërtimin në një biofilm të pjekur të paprekur. Kulturat u rritën për pesë ditë, u holluan në pllaka me puse për pesë ditë të tjera, u konfirmuan me ngjyrosje me violet kristal dhe më pas u gërvishtën për të mbledhur qelizat përpara ekspozimit ndaj barnave. Në 5 mikrogramë për mL, bluja e metilenit e përdorur vetëm e uli numrin në 2.3 herë 10 në fuqinë e 2-të deri në ditën 6, duke qenë ndër agjentët më të mirë të përdorur veçmas, por jo në zero. Të dyja kombinimet me blunë e metilenit arritën zero deri në ditën 6, ashtu si edhe të dyja kombinimet me ciprofloksacinë.

Autorët theksuan të njëjtat kufizime që do të vinte re një lexues i kujdesshëm: biofilm i ri i mbledhur me gërvishtje në vend të një biofilmi të vjetër të paprekur; një përqendrim i vetëm i përshtatshëm për të gjitha barnat në vend të testimit të secilit në përqendrimin e vet kulmor realist; vetëm çifte të përzgjedhura me azitromicinë ose rifampicinë; një shtam; pa kafshë; pa pacientë. Studime të mëvonshme me tre barna u propozuan, por nuk u raportuan.

Krahasimi i projektimit të studimeve

Tabela paraqet në formë të përmbledhur thelbin e këtij artikulli. Gjithçka në të majtë të kolonës së fundit është punë me kultura. Asgjë në asnjërin prej artikujve nuk i përket kolonës së fundit.

Bartonella nuk është Borrelia

Të dy artikujt përmendin Borrelia burgdorferi, spiroketën e sëmundjes Lyme, sepse analiza me ngjyrues vinte nga puna e mëparshme mbi fazën stacionare të Borrelia në të njëjtin laborator, ku edhe bluja e metilenit dhe daptomicina kishin dhënë rezultate pozitive. Kjo histori është kontekst i dobishëm dhe një burim i zakonshëm gabimesh.

Asnjë eksperiment në asnjërin prej artikujve mbi Bartonella nuk e teston Borrelia krahas Bartonella. Organizmat ndryshojnë, mjediset e kultivimit ndryshojnë, përqendrimet ndryshojnë dhe efekti i hamendësuar i blusë së metilenit në membranën e Bartonella u paraqit si spekulim që kërkonte studim të mëtejshëm. Rezultatet nuk duhen transferuar nga një specie te tjetra dhe asnjëri prej artikujve nuk mbështet pretendime të gjera për parazitët. Për këtë arsye, krahasimi i qelizave persistente të Borrelia dhe Bartonella i mban të ndara dy literaturat shkencore.

Pse kulturat nuk shndërrohen në një protokoll

Interesi në kërkime për një protokoll me blunë e metilenit për Bartonella është i kuptueshëm. Këta artikuj janë arsyeja pse kjo frazë duhet trajtuar si një shenjë paralajmëruese dhe jo si një listë blerjesh.

Së pari, 5 mikrogramë për mL në një pus të pllakës nuk është një recetë mjekësore. Kjo vlerë nuk përfshin të dhëna për përthithjen, shpërndarjen, lidhjen me proteinat, depërtimin brenda qelizave apo tolerueshmërinë. Autorët e zgjodhën si një mesatare të përafërt të përqendrimeve kulmore të antibiotikëve dhe thanë se puna e ardhshme duhet ta përdorë secilin bar në nivelin e vet realist.

Së dyti, zero koloni do të thotë se nuk ka koloni në ato kushte mbjelljeje në pllakë, jo se indi është steril. Qelizat persistente, bakteret brenda qelizave dhe kufizimet e marrjes së mostrave mbeten të gjitha jashtë pllakës me agar.

Së treti, kombinimet që sterilizojnë një pus mund të dështojnë ose të shkaktojnë dëm në trup. Azitromicina plus bluja e metilenit dhe rifampicina plus bluja e metilenit janë çifte laboratorike me ekspozime laboratorike. Pa të dhëna farmakokinetike nga kafshët dhe të dhëna nga studime të kontrolluara te njerëzit, nuk ka dozë, kohëzgjatje apo raport përfitim–rrezik të përcaktuar. Kushdo që po shqyrton mundësitë duhet t'i diskutojë ato me një mjek dhe të shqyrtojë se kur përdorimi i blusë së metilenit kërkon mbikëqyrje mjekësore, përpara se të nxjerrë ndonjë përfundim nga të dhënat në enë kultivimi.

Përfundimi i kufizuar që këta artikuj mbështesin është ky: bluja e metilenit ka aktivitet të riprodhueshëm kundër B. henselae JK53 pa rritje in vitro, përfshirë në kombinime laboratorike me dy barna, ndërsa rezultatet më të forta për kombinimet dhe qelizat e marra nga biofilmi vijnë nga studimi i vitit 2020. Gjithçka tjetër, përfshirë nëse ky aktivitet ka rëndësi për bartonelozën te njerëzit, mbetet e patestuar.