Test redukcije metilenskega modrila v vampovi tekočini

Diplomantka pokliče s kmetije z modro epruveto v roki. Pred desetimi minutami je vampovi tekočini dodala metilensko modrilo, modra barva pa je še vedno prisotna. Vpraša, ali naj kravi da več barvila.

To vprašanje razkriva napačno predstavo. Pri testu redukcije metilenskega modrila v vampovi tekočini barvilo dodamo v epruveto, nikoli v žival. Celoten preizkus poteka v epruveti. Merjenje hitrosti izginjanja modre barve nam pove nekaj o mikrobih v vzorcu, ne pa o zdravljenju, ki ga žival potrebuje.

Zmeda je razumljiva, saj se metilensko modrilo pojavlja v treh ločenih veterinarskih kontekstih. Ta članek jih jasno razmejuje in pojasnjuje, kako čas redukcije razlagati skupaj s pH, protozoji, kakovostjo vzorčenja in kliničnimi znaki.

Kaj test dejansko meri

Metilensko modrilo je v oksidirani obliki modro, v reducirani pa skoraj brezbarvno. Sveža vampova tekočina zdrave živali ima močno redukcijsko sposobnost, ker anaerobne bakterije aktivno fermentirajo krmo. Ko v takšno tekočino vmešamo majhno količino barvila, bakterijska presnova v nekaj minutah odpravi barvo.

Načelo delovanja je torej preprosto: aktivna anaerobna flora hitro razbarva modrilo, neaktivna ali poškodovana flora pa počasi. Kratek čas pomeni večjo redukcijsko sposobnost vzorca. Podaljšan čas kaže na zmanjšano mikrobno aktivnost, če je bil vzorec pravilno odvzet in ustrezno obravnavan.

Test ne meri neposredno redoks potenciala vampa. Raziskava metod pri govedu, ki je primerjala redukcijski test z neposrednimi meritvami v milivoltih, ni ugotovila linearne korelacije med časom redukcije in izmerjenim redoks potencialom. Sklenila je, da teh dveh meritev ne smemo obravnavati kot medsebojno zamenljivi meritvi iste spremenljivke. Povzetek celotne primerjave je na voljo na PubMed. Redukcijski test obravnavajte kot funkcionalni preizkus mikrobne populacije, ne kot poceni elektrodo.

Merckov/MSD-jev opis enostavne indigestije pri prežvekovalcih uvršča podaljšan čas redukcije v isti vzorec ugotovitev kot nenormalen pH vampa in zmanjšano število protozojev. Nobena posamezna vrednost ne določa diagnoze. Določa jo celoten vzorec.

Standardni postopek ob živali

Protokoli se med izobraževalnimi ustanovami nekoliko razlikujejo, zato zabeležite natančne uporabljene prostornine in temperaturo ter primerjajte le rezultate, pridobljene po istem protokolu. Ena od pogosto poučevanih različic je:

1. Odvzemite vsaj 10 do 20 mL sveže vampove tekočine s čim manjšo primesjo sline, izpostavljenostjo zraku in ohlajanjem. Test izvedite čim prej.
2. Pripravite 0.03-odstotno metilensko modrilo, kar je 0.3 mg na mL.
3. Dodajte barvilo v količini, ki ustreza 5 odstotkom prostornine tekočine. To pomeni 1.0 mL barvila na 20 mL tekočine ali 0.5 mL barvila na 10 mL tekočine. V obeh primerih je razmerje med tekočino in barvilom enako, 20 proti 1.
4. Drugo epruveto z neobdelano tekočino iz istega vzorca ohranite kot barvno kontrolo.
5. Nežno premešajte, takoj začnite meriti čas in epruveto vzdržujte blizu telesne temperature, približno pri 37 do 39 stopinjah Celzija, odvisno od lokalnega protokola.
6. Zabeležite čas, ko se barva v testni epruveti izenači s kontrolo. Na stiku z zrakom lahko ostane tanek moder obroč, ker kisik tam ponovno oksidira barvilo. Ne čakajte, da izgine tudi ta obroč.

Redoks kemija metilenskega modrila pojasnjuje, zakaj je kisik tukaj pomemben. Močno stresanje, široko odprta epruveta ali dolga zakasnitev omogočajo vstop kisika in ohranjajo modro barvo dlje, kot bi jo razmere v samem vampu. Iz istega razloga so pomembne podrobnosti tehnike odvzema vampove tekočine brez kontaminacije. Slina razredči vzorec in zviša pH, zato številni veterinarji pri odvzemu z želodčno sondo prvi del zavržejo, kadar količina to dopušča.

Kaj merijo različna opažanja

Čas redukcije odgovori le na eno vprašanje. Spodnji pregled ocenjevanja vampa prikazuje, kaj prispeva posamezno opažanje ob živali. Upoštevajte celotno vrstico, ne le ene celice.

Bistvo je v preglednici. Podaljšan čas redukcije skupaj s slabo gibljivimi protozoji, nenormalnim pH in šibkim krčenjem kaže na dejansko zmanjšano mikrobno aktivnost. Osamljen podaljšan čas pri živahni živali, ki prežvekuje in ima živahne protozoje, kaže na težavo z vzorcem, ne z vampom. Pred ukrepanjem ponovite odvzem.

Razlaga časa skupaj s pH in anamnezo

Prehrana določa izhodišče. Obroki, bogati s koncentrati, hitro fermentirajo in lahko barvilo razbarvajo v približno eni minuti, medtem ko lahko pri prehrani s senom to traja več minut, tudi pri zdravih živalih. Kratek čas zato sam po sebi ne dokazuje boljšega zdravja. Dokazuje, da je bilo aktivnim mikrobom na voljo več fermentabilnega substrata.

Huda preobremenitev z žitom prekine ta preprosti trend. Začetna fermentacija ogljikovih hidratov je lahko intenzivna, nato pa poškodbe zaradi kislin zavrejo normalno floro in protozoje, zato se redukcija podaljša. Zato eno od učnih pravil navaja, da test ni veljaven, kadar je pH vampa pod približno 5.5. Takrat se je flora, ki jo testiramo, že spremenila.

Praktične smernice za razlago vzorcev:

• Normalen pH z redukcijo v približno 6 minutah nakazuje funkcionalno aktivno floro.
• Normalen pH z izrazito podaljšano redukcijo nakazuje neaktivnost zaradi anoreksije, protimikrobnega učinka ali neustreznega vzorca.
• Visok pH s podaljšano redukcijo pogosto sledi dolgotrajni anoreksiji z malo substrata, vendar upoštevajte tudi možnost kontaminacije s slino pri odvzemu s sondo.
• Nizek pH z zmanjšano aktivnostjo protozojev vzbuja sum na disbiozo, povezano z ogljikovimi hidrati. Pri tem pomagajo smernice za razlago pH vampa. Vrednosti pod 5.5 skupaj s splošno prizadetostjo živali usmerjajo stran od enostavne indigestije proti preobremenitvi z žitom in hudi acidozi.

Vedno zabeležite nedavno peroralno dajanje tetraciklinov, ionofore v krmi, dolgotrajno uporabo sistemskih protimikrobnih zdravil, nenadne spremembe obroka, trajanje anoreksije in vnos vode. Priročnik MSD izrecno opozarja, da lahko peroralni tetraciklini znatno zavrejo vampovo mikrofloro. Ionofori namenoma spreminjajo bakterijske populacije. Brez teh podatkov iz anamneze podaljšanega časa ni mogoče razlagati.

Kakovost vzorčenja je enako pomembna. V nadzorovani raziskavi so imeli vzorci, odvzeti z želodčno sondo, višji pH in manj hlapnih maščobnih kislin kot vzorci, odvzeti skozi kanilo pri istih živalih, predvsem zaradi sline. Pri vseh preizkušenih prostorninah se je čas redukcije do 60 minut po odvzemu znatno podaljšal, najbolj pri majhnih vzorcih. Odvzemite vsaj 10 mL, test izvedite v 30 minutah, redukcijski test opravite med prvimi, vzorec ohranjajte topel in čim bolj omejite stik z zrakom.

Tri uporabe, ki jih ne smemo zamenjevati

Isto barvilo, trije različni sistemi.

Prvi je tukaj opisani preizkus vampove tekočine. Vzorec je odvzeta vampova tekočina. Barvilo dodamo in vitro pri koncentraciji 0.03 odstotka. Končna meritev je čas do razbarvanja. Namen je ocena mikrobne redukcijske aktivnosti.

Drugi je dajanje metilenskega modrila živemu prežvekovalcu. Uveljavljen primer je intravensko zdravljenje zastrupitve z nitrati ali nitriti z methemoglobinemijo, pri katerem zdravilo ponovno vzpostavi funkcionalni hemoglobin. Upoštevati je treba pravila glede odmerka, formulacije, ostankov in karence. Ta odločitev nima nobene povezave z merjenjem časa v epruveti. Če se barvilo pri določenem postopku uporablja kot sledilo in vivo, je bistveno, kam potuje, ne pa kako hitro ga vampovi mikrobi reducirajo.

Tretji je redukcijski test mleka. Vzorec je mleko. Barvilo dodamo vzorcu mleka. Hitro izginjanje modre barve praviloma kaže na večjo mikrobno aktivnost in slabšo obstojnost, počasna redukcija pa na boljšo kakovost. Test spada v mikrobiologijo živil in preverjanje kakovosti mleka, ne v medicino vampa, in ne določa števila bakterij.

Jasna poimenovanja preprečujejo napake: čas redukcije v vampovi tekočini, sistemsko zdravljenje z metilenskim modrilom ali njegova uporaba kot sledila ter redukcijski test mleka. Varnostno pravilo lahko strnemo v en stavek. Barvilo za preizkus vampove tekočine ostane v laboratorijski epruveti, ki jo nato zavržemo. Za izvedbo testa ga nikoli ne dajemo živali.

Strnjeno pravilo za klic s kmetije

Standardizirajte barvilo pri koncentraciji 0.03 odstotka in razmerju 1 del barvila na 20 delov tekočine, svežo tekočino testirajte blizu telesne temperature v primerjavi z neobdelano kontrolo ter čas v minutah razlagajte skupaj s pH, gibljivostjo protozojev, kakovostjo odvzema, prehrano, zdravili, krčenjem vampa, apetitom, blatom in hidracijo. Osamljena številka nikoli ne določa diagnoze indigestije. Določa jo skladen vzorec ugotovitev.