Članek
Test redukcije metilenskega modrila v mleku: načelo in omejitve
Študentka dvigne dve epruveti z mlekom. V eni je mleko v eni uri postalo belo. V drugi je ostalo modro pet ur. Pokaže na modro in reče, da je to mleko varno za pitje.
Tak sklep razkriva napačno razumevanje. Test mleka z metilenskim modrilom ne ugotavlja varnosti. Pokaže, kako hitro mikrobna populacija v epruveti v nespremenljivih pogojih znižuje redoks potencial. Počasen rezultat pomeni nizko skupno presnovno aktivnost v vzorcu. Ne pove ničesar o tem, kateri organizmi so prisotni, ali je med njimi patogen oziroma ali je bilo mleko pravilno pasterizirano.
To razlikovanje je pomembno, saj je test videti prepričljiv. Modra barva izgine. Ura poda številko. Številke vabijo k pretiranemu razlaganju. Ta članek ohranja uporabno razlago in preprečuje nevarno.
Kaj redukcija dejansko meri
Metilensko modrilo je v oksidirani obliki modro, po redukciji v levkometilensko modrilo pa skoraj brezbarvno. Sveže mleko vsebuje raztopljeni kisik, ki barvilo ohranja modro. Bakterije, ki izvajajo dihanje in fermentacijo, porabljajo ta kisik in sproščajo redukcijske spojine. Ko redoks potencial dovolj pade, barvilo sprejme elektrone in izgubi barvo. Besedilo o mikrobiologiji mleka Univerze v Guelphu opisuje enako zaporedje: odstranitvi kisika sledi nastajanje redukcijskih snovi med bakterijsko presnovo.
Klasična raziskava v reviji Journal of Dairy Science to opredeljuje kot dvostopenjski proces: mikroflora najprej porabi kisik, nato pa sestavine mleka hitro reducirajo barvilo. Test redukcije metilenskega modrila v mleku je zato najbolje razumeti kot funkcionalni preskus skupne presnovne aktivnosti, ne kot števec celic. Redoks obnašanje metilenskega modrila pojasnjuje kemijo te spremembe.
Kisik obrne spremembo, ki označuje končno točko. Reducirano levkobarvilo se ob izpostavitvi zraku ponovno oksidira in spet postane modro. Stresanje, prelivanje, široke epruvete in velik zračni prostor nad vzorcem zato zakasnijo rezultat. Na površini v stiku z zrakom pogosto ostane tanek moder obroč, potem ko se preostala vsebina epruvete že razbarva. Standardni postopki ta obroč dopuščajo in ne čakajo, da izgine.
Vrsta organizmov povzroča še drugo odstopanje. Koliformne bakterije in številni mlečnokislinski organizmi hitro reducirajo barvilo. Številni psihrotrofni in termodurični organizmi ga reducirajo počasi ali skoraj sploh ne. Pri dveh vzorcih mleka z enakim številom kolonij na plošči lahko modra barva izgine z večurnim razmikom. Že to dejstvo izključuje pretvarjanje časa v število kolonij.
Nadzorovan laboratorijski postopek
Terenske in učbeniške različice se razlikujejo v podrobnostih, zato je rezultat veljaven le v okviru metode, s katero je bil pridobljen. Običajna različica za živilski laboratorij poteka takole:
- Odvzemite surovo mleko ob čim manjšem vnosu zraka in ga nemudoma ohladite. Pred odvzemom vzorca ga premešajte z nežnim obračanjem posode.
- V sterilno epruveto odmerite 10 mL mleka in 1 mL delovne raztopine barvila. Ena pogosto uporabljena delovna koncentracija je 0.005 odstotka barvila, z razmerjem med mlekom in barvilom 10 proti 1.
- Epruveto zamašite, jo dvakrat nežno obrnite in jo v nekaj minutah postavite v vodno kopel. Običajna inkubacija poteka pri 35 do 38 stopinjah Celzija, odvisno od izbranega standarda. Zabeležite, katerega upoštevate.
- Med inkubacijo epruvete zaščitite pred svetlobo, saj svetloba pospešuje redukcijo.
- Odčitajte po 30 minutah, nato v stalnih časovnih presledkih. Končna točka je čas, ko se barva vsebine epruvete ujema z referenčnim prekuhanim mlekom ali ko doseže izgubo barve, opredeljeno v postopku.
- Kadar metoda to zahteva, ohranite epruveto z neobdelanim vzorcem istega mleka kot vizualno kontrolo.
Priročnik FAO za testiranje mleka podaja izrecno terensko različico tega zaporedja z 10 mL mleka in 1 mL barvila, zamašitvijo, nežnim obračanjem, inkubacijo pri približno 37 do 38 stopinjah in odčitavanjem vsakih 30 minut. V kontrolnih epruvetah se uporablja prekuhano mleko, da se uniči naravni redukcijski sistem in zagotovi referenca za primerjavo barve.
Zgornja shema opredeljuje okvir nadzora. Enake prostornine, enako barvilo, enaka temperatura, enako mešanje, enaka zaščita pred svetlobo, enako pravilo za končno točko. Če spremenite karkoli od tega, se spremeni tudi izmerjeni čas. Zato domače različice s poljubno koncentracijo barvila niso primerljive z laboratorijskimi razredi.
Kaj kaže čas redukcije
Daljši čas pomeni nižjo skupno aktivnost v navedenih pogojih. Krajši čas pomeni višjo skupno aktivnost. Učne preglednice za mlekarstvo tem časom pripisujejo okvirne razrede, na primer 5 ali več ur kot zelo dobro in manj kot 30 minut kot slabo v eni shemi, izpeljani iz BIS.
Ključno sporočilo je razpon med shemami. Rezultat 5 ur nima univerzalnega razreda. Spada v okvir postopka, ki ga je opredelil. Utemeljena oblika poročanja je zato:
MBRT je X ur po navedeni metodi, kar ustreza razredu po tej metodi.
Nikoli pa ne velja, da je MBRT X enot, ki tvorijo kolonije, na mL. Smernice, izpeljane iz Standard Methods, navajajo, da rezultatov redukcije barvila ne smemo poročati kot število bakterij. Tudi postopek enostavnega barvanja z metilenskim modrilom odgovarja na drugo vprašanje, saj pod mikroskopom pokaže obliko celic, ne pa skupne aktivnosti v epruveti.
Preglednica razlage in omejitev
Ta preglednica je izvirna referenca za članek. Preberite celotno vrstico. Nobena posamezna celica ne stoji zase.
| Opažanje ali trditev | Kaj kaže | Česa ne more dokazati | Glavni moteči dejavniki |
|---|---|---|---|
| Hitra izguba modre barve, v manj kot 2 urah po eni shemi za surovo mleko | Visoka redukcijska aktivnost, skladna z veliko mikrobno obremenitvijo ali slabo obstojnostjo | Vrste, natančnega števila, toksinov ali neuspešne pasterizacije | Shranjevanje na toplem, mikroflora z veliko koliformnimi bakterijami, svetloba, majhna količina barvila |
| Vmesni čas, 2 do 4 ure | Zmerna aktivnost; razred velja le znotraj navedene sheme | Varnosti ali odsotnosti počasi reducirajočih organizmov | Visoka temperatura inkubacije, razlike v vnosu zraka, ločevanje maščobe |
| Počasna redukcija, 5 ali več ur | Nizka skupna aktivnost v tej shemi | Odsotnosti patogenov, pasterizacije ali kemijske varnosti | Ostanki antibiotikov, konzervansi, dodatni raztopljeni kisik, velika količina barvila |
| Moder obroč ostane na površini, medtem ko se preostala vsebina razbarva | Ponovna oksidacija na meji z zrakom, običajen robni učinek | Neuspešnega testa ali nepopolne reakcije | Široka epruveta, slabo prilegajoč se zamašek, večkratno odpiranje zaradi pregleda |
| Bela epruveta po inkubaciji segretega mleka | Spremenjen redukcijski sistem skupaj z aktivnostjo preživelih organizmov | Da je segrevanje ustrezalo validirani pasterizaciji | Toplotne poškodbe, obnova med inkubacijo, poznejša kontaminacija |
| Katerakoli posamezna vrednost MBRT, navedena brez metode | Neznane pogoje testa | Kateregakoli razreda ali števila | Formulacija barvila, razmerje, temperatura, mešanje in pravilo za končno točko niso navedeni |
Preskusi, ki temeljijo na rasti, na primer uporaba gojišč za bakterije, ostajajo pot do določanja števila in izolacije. Redukcijska epruveta omogoča presejanje. Plošča omogoča identifikacijo in štetje.
Česa test ne more dokazati glede varnosti
Počasen rezultat ne more dokazati odsotnosti patogenov. Patogen, prisoten v klinično pomembni količini, lahko le malo prispeva k skupni porabi kisika. Odkrivanje patogenov zahteva metode, specifične za posamezne organizme, kar aktualni Standard Methods obravnava kot področje, ločeno od splošnega presejanja kakovosti.
Test ne more potrditi pasterizacije. Za preverjanje toplotne obdelave se po smernicah Codex za higieno mleka uporablja test alkalne fosfataze ali druga validirana metoda. Bela ali modra epruveta ne pove ničesar o časovnem in temperaturnem poteku obdelave serije.
Test ne more potrditi varnosti živila. Varnost je odvisna od patogenov, že nastalih toksinov, ostankov zdravil, kemičnih onesnaževal, poteka hladne verige in kontaminacije po vzorčenju. Codex varnost mleka in mlečnih izdelkov obravnava kot verigo nadzornih ukrepov, ne kot en sam rezultat presejanja.
Okolje živilskega laboratorija ni domače testiranje
V mlekarskem laboratoriju se test uporablja za presejanje mleka ob prevzemu, primerjavo dobaviteljev skozi čas ali poučevanje redoks mikrobiologije pod nadzorom. Vzorci so sledljivi. Reagenti so standardizirani. Temperature se beležijo. Odpadki se odstranijo po laboratorijskih postopkih.
Pri domačem testiranju tega ni. Prostornine, odmerjene v kuhinji, so približne. Koncentracije barvil, ki se prodajajo na spletu, se močno razlikujejo. Inkubacija pogosto poteka v toplem prostoru namesto v umerjeni kopeli. Barva se kljub temu spremeni, zato je rezultat videti zanesljiv, čeprav manjkajo vsi nadzorni ukrepi, ki so mu dajali pomen.
Večje tveganje je vedenjsko. Modra epruveta doma spodbuja pitje surovega mleka, ki bi ga laboratorij še vedno poslal na štetje kolonij na ploščah, presejanje patogenov in preverjanje ostankov. Test mleka z metilenskim modrilom je bil zasnovan za razvrščanje surovega mleka ob prevzemu, ne za odobritev mleka za uživanje. Hitrejše presejanje z resazurinom ima enako omejitev: hitrejši barvni odčitek, vendar še vedno brez odgovora glede patogenov.
Kratko pravilo za laboratorijsko mizo
Standardizirajte barvilo, razmerje, temperaturo, mešanje, svetlobo in končno točko. Čas poročajte skupaj z imenom metode in razredom. Izmerjeni čas razlagajte ob upoštevanju pogojev shranjevanja, vrste mikroflore, ostankov in kakovosti vzorčenja. Kratek čas opozarja na aktivnost, ki jo je vredno raziskati. Dolg čas nikoli ne potrjuje varnosti.