Odčitavanje E. coli in videza drugih kolonij na agarju EMB

Študent neznani vzorec s potezami nacepi na agar z eozinom in metilenskim modrilom, ga inkubira čez noč in se vrne k plošči s temnimi kolonijami z zelenim lesketanjem. V laboratorijski dnevnik zapiše »E. coli, potrjeno.« Ta zapis trdi več, kot lahko plošča utemelji. Plošča kaže fenotip rasti in fermentacije v določenih pogojih. Identiteta vrste je ločena trditev, ki zahteva ločene dokaze.

Ta vodnik obravnava rezultate na agarju EMB kot nalogo interpretacije. Pojasnjuje osnovno načelo, vodi skozi ilustrativni atlas plošč s kontrolami in navaja primere, v katerih je učbeniška podoba zavajajoča.

Načelo delovanja plošče

Agar EMB je hkrati selektiven in diferencialen. Barvili eozin Y in metilensko modrilo zavirata številne po Gramu pozitivne organizme, zato gojišče daje prednost rasti po Gramu negativnih organizmov. Isti barvili delujeta tudi kot indikatorja: ko organizem fermentira razpoložljivi sladkor in lokalno proizvede dovolj kisline, kolonija močno veže barvilo in postane temno vijolična do modro črna. Ob intenzivnem nastajanju kisline lahko površina kolonije kaže kovinsko zeleno iridescenco. Protokol ASM za plošče z agarjem z eozinom in metilenskim modrilom opisuje to kombinacijo selekcije in diferenciacije ter vsebuje referenčne fotografije za poučevanje.

Pred odčitavanjem katerega koli rezultata je pomembna ena podrobnost: preverite, katera sestava gojišča je v uporabi. Starejša sestava Holt Harris Teague vsebuje laktozo in saharozo, medtem ko Levine EMB vsebuje samo laktozo. Organizem, ki fermentira saharozo, ne pa laktoze, kot številni izolati Serratia marcescens, je lahko na obeh različicah videti drugače. Dokumentacija proizvajalca za gojišča EMB to razliko v sestavi izrecno navaja. V laboratorijski dnevnik ob rezultatu zapišite proizvajalca in sestavo gojišča.

Pripravljen, nenacepljen agar EMB je običajno rdeče rjav do rdečkasto vijoličen, včasih z zelenkastim odtenkom ali drobno oborino. Ta barva ozadja ni rast. Vsako odčitavanje primerjajte z nenacepljeno ploščo ali dokumentiranim začetnim videzom in primarno ploščo odčitajte po približno 18 do 24 urah aerobne inkubacije pri 35 do 37 C, razen če učni protokol določa drugače. Daljša inkubacija lahko spremeni videz fermentacije.

Kako opazovati ploščo

Uporabite dve vrsti osvetlitve. Najprej ploščo preglejte v odbiti ali poševno vpadni svetlobi in jo nagnite: kovinski lesk je iridescenten ter se lahko glede na kot opazovanja pojavi ali izgine. Nato jo preglejte v presevni svetlobi, da ocenite barvo kolonij in temna središča. Opazujte dobro ločene kolonije, saj gosta rast in sosednje kolonije spreminjajo lokalno kopičenje kisline ter lahko oslabijo ali poudarijo barvo. Zbirka slik ASM to neposredno prikazuje: E. coli lahko v mešani kulturi izgubi pričakovani lesk, ker okoliški organizmi spremenijo kislost okolja.

Vključite kontrole, kadar vaja to omogoča. Pogost učni nabor vključuje E. coli ATCC 25922 za fenotip modro črne barve in kovinskega leska, nefermentirajoči organizem, kot je Salmonella Typhimurium ATCC 14028 ali Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, za brezbarvni fenotip ter po Gramu pozitiven organizem, kot je Enterococcus faecalis ali Staphylococcus aureus, kot kontrolo inhibicije, kot je navedeno v standardnih preglednicah kontrole kakovosti za gojišča EMB. Če pozitivna kontrola nima leska, najprej posumite na inkubacijo, gosto rast ali sestavo gojišča, šele nato na neznani vzorec.

Ilustrativni atlas plošč

Spodnje plošče so ustvarjene ilustracije, ne fotografije resničnih kultur. Prikazujejo vzorec, ki ga iščemo, ne pa natančnega odtenka posameznega seva. Primerjajte jih z referenčnimi fotografijami ASM in z resničnimi ploščami iz učnega laboratorija.

Plošča 1: Escherichia coli na agarju EMB, intenzivna fermentacija laktoze

E. coli je na agarju EMB običajno temno vijolična do modro črna, pogosto s temnim središčem in kovinsko zelenim leskom zaradi intenzivnega nastajanja kisline. Lesk je dobro znana značilnost, ki jo študenti iščejo, vendar ga obravnavajte kot podporni dokaz, ne kot opredelitev. Intenzivnost leska se spreminja glede na sev, čas inkubacije, gostoto kolonij in kot opazovanja. Odsotnost leska ne izključuje E. coli, temna kolonija brez leska pa lahko kaže na več drugih fermentirajočih organizmov. Za vsako nadaljnje delo izberite dobro ločeno kolonijo, namesto da bi odčitavali gosto porasel del plošče.

Plošča 2: Klebsiella pneumoniae na agarju EMB, sluzast fermentirajoči organizem

Klebsiella pneumoniae na agarju EMB običajno tvori velike, sijoče, sluzaste kolonije v rožnato vijoličnih do rjavo vijoličnih odtenkih, pogosto s temnimi središči, vendar navadno brez izrazitega kovinskega leska. Podobno morfologijo imajo sorodni fermentirajoči organizmi, kot je Enterobacter. Sluzasta tekstura in velikost kolonije sta del odčitavanja: majhna in ploščata rožnata kolonija ima drugačno interpretativno težo kot velika, kupolasta, sluzasta kolonija. Tako kot pri E. coli plošča nakazuje fenotip fermentacije, poimenovanje na ravni vrste pa zahteva biokemijsko potrditev, opisano spodaj.

Plošča 3: Salmonella na agarju EMB in drugi nefermentirajoči organizmi, brezbarvne kolonije

Salmonella na agarju EMB in sorodni organizmi, ki ne fermentirajo laktoze, vključno s Shigella in številnimi izolati Pseudomonas, običajno rastejo kot brezbarvne do prosojne ali bledo jantarne kolonije. Pri nekaterih sestavah gojišča in pogojih se pojavi rahel rožnat odtenek, zato bledo rožnata kolonija ne pomeni samodejno fermentirajočega organizma. EMB ne razlikuje Salmonella od Shigella ali drugih nefermentirajočih organizmov; to razlikovanje je naloga poznejših testov. Upoštevajte tudi, da so bili dokumentirani laktozno pozitivni sevi Salmonella s kovinskimi kolonijami, podobnimi E. coli, kar je še en razlog, zakaj ena sama plošča ne more dokončno razrešiti identifikacije.

Plošča 4: Serratia marcescens in past sestave gojišča

Serratia marcescens si zasluži svoj razdelek, ker študenti pogosto pričakujejo rdeče kolonije in nato ploščo napačno interpretirajo. Večina kliničnih izolatov ne fermentira laktoze, zato so na Levine EMB pogosto bledi do šibko obarvani. Ker številni izolati fermentirajo saharozo, lahko sestava, ki vsebuje saharozo, povzroči temnejšo reakcijo ali reakcijo, izraziteje povezano z nastajanjem kisline. Pri 35 do 37 C prav tako ne pričakujte značilnega rdečega pigmenta prodigiozina; nastajanje pigmenta pri temperaturi inkubatorja ni zanesljivo. Kadar protokol omenja Serratia marcescens na agarju EMB, preverite, katero sestavo gojišča navedba predpostavlja. Pregled presnove Serratia povzema vzorec odsotnosti fermentacije laktoze in variabilne fermentacije saharoze, ki je v ozadju te pasti.

Plošča 5: kontrole in inhibirani organizmi

Po Gramu pozitivni organizmi, kot so Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus in Bacillus, so na agarju EMB praviloma inhibirani ali izrazito zavrti, čeprav inhibicija ni popolna pri vseh sevih. Nabor kontrol zagotavlja zanesljivejše odčitavanje: kontrola E. coli bi morala pokazati dobro rast z modro črno barvo in leskom, kontrola nefermentirajočega organizma brezbarvno rast, kontrola inhibicije pa malo rasti ali nič. Če kontrola inhibicije dobro raste, je selektivni korak odpovedal in vsa druga odčitavanja te serije so vprašljiva. Metode barvanja odgovarjajo na drugačno vprašanje kot gojišča; za barvanje preparatov v laboratoriju si oglejte atlas barvanja z metilenskim modrilom.

Primerjava z jasno določenimi omejitvami

Tri povedi povzemajo zavajajoče videze. Temna barva ne pomeni E. coli, saj Klebsiella, Enterobacter in drugi fermentirajoči organizmi razvijejo temna središča brez leska. Rožnata barva ne pomeni Klebsiella, saj so zmerno ali počasi fermentirajoči organizmi in nekateri sicer nefermentirajoči organizmi videti rožnati ali svetlo vijolični. Lesk ne pomeni dokončne potrditve E. coli, saj ga lahko ustvarijo tudi drugi intenzivno fermentirajoči organizmi. Učni protokol in njegove slike mešanih kultur ponazarjajo vsako od teh napačnih sklepanj.

Omejitve potrjevanja

Agar EMB pokaže fenotip, ne vrste. Različni organizmi imajo lahko enak videz kolonij, isti organizem pa lahko odstopa od svoje učbeniške podobe glede na sev, starost, gostoto rasti, sestavo gojišča in inkubacijo. Zato se v učnih in kliničnih postopkih morfologija na EMB obravnava kot podlaga za domnevno identifikacijo.

Utemeljen študentski postopek je naslednji: opišite ločeno kolonijo (velikost, barvo, središče, lesk v poševni svetlobi, sluzastost), zabeležite sestavo gojišča, čas in temperaturo inkubacije ter kontrole; nato dobro ločeno kolonijo precepite za pridobitev čiste kulture, preden opravite kateri koli potrditveni test. Običajni nadaljnji postopki vključujejo barvanje po Gramu in reakcije IMViC za domnevno identifikacijo E. coli in koliformnih bakterij, TSI ali KIA ter biokemijske panele, specifične za posamezne organizme, pri črevesnih organizmih, skupaj s serološko identifikacijo, MALDI TOF ali drugimi validiranimi metodami identifikacije, kadar naloga to zahteva. Za ozadje o tem, kako se EMB umešča med selektivna in diferencialna gojišča za črevesne organizme, si oglejte uvode v gojišča za črevesne organizme in nadaljnje postopke z barvanjem po Gramu. Pri sorodnem vprašanju, kaj lahko modro obarvan preparat dokaže in česa ne, atlas barvanja z metilenskim modrilom v istem duhu ločuje opažanje od sklepa.

Opažanje zapišite pred sklepom. »Temno modro črne kolonije z zelenim leskom, odvisnim od kota opazovanja, na Levine EMB po 24 urah, skladno z intenzivno fermentacijo laktoze« je utemeljen zapis. »E. coli, potrjeno« zahteva potrditveni korak, ki ga sama plošča ne more zagotoviti.