Testi kvasovk z metilenskim modrilom: štetje živih celic ali merjenje časa respiracije

Na laboratorijski mizi stojita dve epruveti. Obe sta modri. Pri eni modre celice pod mikroskopom pomenijo mrtve kvasovke. Pri drugi epruveta, ki se iz modre spremeni v brezbarvno, pomeni, da so kvasovke žive in respirirajo. Isto barvilo, nasprotna razlaga rezultatov. Če zamenjate testa, se vsak sklep obrne.

Ta razlika je bistvo celotnega članka. Metilensko modrilo je redoks barvilo: v oksidirani obliki je modro, v reducirani pa je brezbarvno levkometilensko modrilo. Štetje viabilnih celic izkorišča to kemijo pri kratkem mikroskopskem pregledu. Poskus respiracije jo izkorišča pri časovno spremljani reakciji v celotni zmesi. Vsak test potrebuje svoj protokol, svoje kontrole in svojo mero skepticizma.

Štetje viabilnih celic: kratko barvanje, takojšen pregled

Pivovarski protokol je najbolj standardizirana različica. Pripravite 0.01% w/v metilensko modrilo v 2% natrijevem citratu, ga zmešajte s suspenzijo kvasovk v razmerju 1:1 in zmes preglejte po kratkem, določenem časovnem intervalu. Objavljeni intervali segajo od 1 do 2 minut v priročniku Brewing Science Institute do približno 5 minut v raziskovalnih protokolih, metoda OIV za mikrobiologijo vina pa zahteva pregled v 10 minutah. Končna koncentracija barvila v zmesi za štetje je približno 0.005%. Napolnite izboljšano Neubauerjevo komoro in pri približno 400x povečavi temno modre celice razvrstite kot neviabilne, neobarvane pa kot viabilne. Pri metodi OIV se svetlo modre celice štejejo kot žive, kar že nakazuje težavo subjektivnosti, obravnavano v nadaljevanju.

Koncentracijo celic določimo iz geometrije komore. Če preštejemo celoten osrednji kvadrat s stranico 1 mm, je število celic na mL enako N krat faktor redčenja krat 10^4, pri čemer je N število celic na tem območju, kot je navedeno v metodah ASBC za kvasovke. Viabilnost izračunamo preprosteje: število neobarvanih celic delimo s skupnim številom celic in pomnožimo s 100. Za oceno viabilnosti preštejte približno 400 celic, skladno s primerjalno pivovarsko študijo FEMS in prakso OIV. Dosledno uporabljajte eno pravilo za celice na mejah mreže, na primer vključite celice na spodnjih in levih črtah mreže, izključite pa tiste na zgornjih in desnih.

Pravilo za brste določite pred začetkom štetja. Po pogosti konvenciji brst štejemo kot ločeno celico, ko doseže približno polovico velikosti materinske celice, manjše brste pa štejemo skupaj z materinsko celico. Ne glede na izbrano pravilo ga uporabljajte v vsakem kvadratu in ga zapišite na delovni list, da ga bo naslednja oseba uporabila enako.

Delovni list za štetje (natisnite ga)

Ta delovni list je izvirno gradivo za ta članek. Prepišite ga v laboratorijski dnevnik ali natisnite po enega za vsak vzorec.

Viabilnost (%) = 100 x neobarvane / (neobarvane + temno modre). Skupno število celic na mL = N x faktor redčenja x 10^4, pri čemer N izhaja iz določenega območja komore. Ob rezultatu zabeležite čas barvanja, saj podatka o viabilnosti brez tega časa ni mogoče reproducirati.

Zakaj se vrednosti viabilnosti spreminjajo

Čas je prvi moteči dejavnik in vpliva v obe smeri. Presnovno aktivne celice reducirajo barvilo, zato jih lahko ob prezgodnjem pregledu opazimo, preden redukcijo dokončajo, in jih napačno razvrstimo kot mrtve. Toda dolgotrajna izpostavljenost je sama po sebi toksična in povzroči dejansko poškodovane modre celice, zaradi česar obarvanje lažno kaže na odmrtje. Laboratorijski učni protokol zato določa ocenjevanje v 5 minutah, kot je dokumentirano v učnem protokolu za kvasovke iz Wisconsina. Zanesljiva ugotovitev je, da je ocenjevanje z metilenskim modrilom odvisno od časa, zato določite en kratek interval in ga ohranite enakega pri vseh vzorcih v seriji.

Vzorci z nizko viabilnostjo prinašajo drugo pristranskost. Standardizirana metoda opozarja, da lahko metilensko modrilo preceni dejansko viabilnost pod približno 80%, saj celice, ki še reducirajo barvilo, niso nujno ohranile sposobnosti razmnoževanja. Pivovarska literatura opisuje enako nezanesljivost pri močno zmanjšani viabilnosti. Metilensko modrilo obravnavajte kot hitro približno oceno, ključne odločitve pri nizki viabilnosti, kot je ponovna uporaba kulture za inokulacijo, pa potrdite s štetjem kolonij na ploščah ali dopolnilnim barvanjem.

Tretji so vplivi matriksa. Metoda OIV poteka pri pH približno 4.6 in opozarja, da močno pufrani vzorci z nizkim pH preprečujejo pravilno delovanje barvila, hkrati pa odsvetuje test pri vsebnosti sladkorja nad 100 g/L, kjer so celice zavajajoče svetlo modre. Eksperimentalna primerjava pH pri barvanju je v preizkušenem območju pokazala znatne spremembe občutljivosti, skladno s študijo metode z metilenskim modrilom, odvisne od pH. Drobir je ločena past: obarvani delci v nečistih drozgah spominjajo na mrtve celice in povečujejo razlike med izvajalci.

Te razlike so izmerjene, ne le opisane iz izkušenj. V šestmesečnem pivovarskem preizkusu, objavljenem v primerjalni študiji kvasovk FEMS, je povprečni standardni odklon meritev z metilenskim modrilom v dvojniku znašal 6.1%, pri pretočni citometriji z oksonolom pa 0.2%; rezultata dveh izvajalcev sta se pri istem vzorcu razlikovala za do 13 odstotnih točk. Kvantitativna primerjava metod za določanje viabilnosti iz leta 2023 je pokazala bistveno večjo natančnost fluorescenčne mikroskopije in pretočne citometrije, obenem pa tudi odvisnost uspešnosti metode od vrste in matriksa. Klasični opis metode avtorjev Painting in Kirsop (PMID 24430080) ostaja referenčno izhodišče, širši pregled testov viabilnosti in vitalnosti kvasovk (PMID 25154541) pa metilensko modrilo uvršča med dopolnilne in ne dokončne teste. Tripansko modrilo tu ni samodejno boljša izbira: kaže izgubo celovitosti membrane, metilensko modrilo pa privzem barvila in redukcijsko aktivnost, zato se lahko celice pod stresom z obema barviloma razvrstijo različno.

Poskus respiracije: merite čas izginjanja modre barve

Pri drugem testu mikroskopa sploh ne uporabljamo. Kvasovke, glukozo in razredčeno metilensko modrilo damo v zaprto epruveto, z uro pa merimo, koliko časa traja, da modra barva izgine. Celice med presnovo ustvarjajo redukcijske ekvivalente, ki modro barvilo pretvorijo v brezbarvno obliko, raztopljeni kisik pa ga oksidira nazaj. Ko celice zmanjšajo količino kisika, prevlada neto redukcija in epruveta se razbarva. Končna točka zato odraža ravnovesje med respiracijo, koncentracijo barvila in razpoložljivostjo kisika; rezultat je treba navesti kot čas redukcije ali razbarvanja metilenskega modrila, ne kot neposredno hitrost porabe molekularnega kisika.

Uporabite precej bolj razredčeno barvilo kot pri določanju viabilnosti, da bo izmerjeni čas v priročnem območju. Priročnik AQA za obvezne praktične vaje na ravni A level to dobro standardizira: 1 g glukoze na 100 mL vode, segrete na približno 30 C, 5 g suhih kvasovk, dodanih tik pred uporabo, in delovna raztopina barvila s koncentracijo približno 0.001%, pripravljena z redčenjem 0.1 mL 1% osnovne raztopine na 100 mL. Zmešajte 2 mL suspenzije kvasovk in glukoze z 2 mL delovne raztopine barvila, pustite, da se temperatura zmesi izenači s preskusno temperaturo, enkrat stresajte 10 sekund, zaženite štoparico in ne stresajte več. Stresanje ponovno vnese kisik in epruveto znova obarva modro, kar je največji postopkovni artefakt. AQA navaja, da naj bi se pripravek pri 35 C običajno razbarval v približno 5 minutah; povprečni časi v preizkusu so bili 275 s pri 20 C, 128 s pri 35 C in 145 s pri 45 C. To so primeri iz ene poskusne postavitve, ne univerzalna merila. Kvantitativno povezavo med hitrostjo redukcije in presnovno aktivnimi kvasovkami v nadzorovanih pogojih podpirajo namenske študije redukcije, vključno z delom, indeksiranim kot PMID 25773544, in študijo mehanizma v reviji Yeast (2014).

Prikaz časovnega poteka (izvirno gradivo)

Spodnja tabela je izvirni prikaz, pripravljen za ta članek z zgoraj opisano postavitvijo po vzoru AQA: 2 mL zmesi kvasovk in glukoze ter 2 mL delovne raztopine barvila s koncentracijo približno 0.001%, enkratno 10-sekundno stresanje, nato inkubacija brez premikanja. Vnosi so primeri odčitkov v obliki, ki naj jo uporablja skupina študentov, pri čemer je indeks hitrosti opredeljen kot 1, deljeno s časom razbarvanja v sekundah. Izvedite poskus z enakimi epruvetami in te vnose nadomestite z izmerjenimi vrednostmi.

Za epruvete A, B in C narišite indeks hitrosti v odvisnosti od temperature. Krivulja najprej narašča, nato se izravna ali začne padati, kar je pričakovan vzorec encimsko vodenega procesa, ne ravna črta. Epruvete D, E in F niso podatkovne točke na tej krivulji. So kontrole, ki omogočajo njeno razlago.

Kontrole, ki dajejo posameznemu testu pomen

Vsaka izvedba poskusa respiracije potrebuje tri spremljajoče kontrole. Prekuhane ali usmrčene kvasovke z glukozo in barvilom morajo ostati modre, kar dokazuje, da je hitra redukcija odvisna od presnove živih celic. Žive kvasovke z barvilom brez dodane glukoze so substratna kontrola, vendar tudi tu pričakujte počasno razbarvanje, saj kvasovke porabljajo endogene zaloge. Glukoza z barvilom brez kvasovk je kemijski slepi vzorec, ki je nujen, ker lahko glukoza v alkalnem okolju reducira metilensko modrilo brez prisotnosti celic.

Štetje viabilnih celic potrebuje drugačno vrsto nadzora: nespremenljivost postopka. Ista osnovna raztopina barvila, isto razmerje mešanja, isti čas barvanja, isto območje komore, ista pravila za brste in celice na mejah ter, kjer je mogoče, slepo štetje. Če se rezultata dveh izvajalcev razlikujeta za deset točk, delovni list običajno razkrije vzrok: različen čas, različen prag za modro obarvanost ali različna pravila za brste. Tehnike priprave in opazovanja obarvanih celic so povezane z metodami enostavnega barvanja bakterij, širši pregled tega, kaj barvilo označuje v različnih vzorcih, pa najdete v atlasu mikroskopskega barvanja. Fizikalno ozadje kvantitativnega odčitavanja katerekoli intenzivnosti modre barve pojasnjuje referenca absorpcije z navedenimi pogoji: vsak koeficient mora biti podan skupaj s pogoji glede topila, pH in koncentracije.

Test izberite glede na vprašanje. Koliko celic je v tem trenutku živih, je vprašanje štetja, na katero odgovorimo z mikroskopom in delovnim listom. Kako aktivno kultura respirira, je kinetično vprašanje, na katero odgovorimo s štoparico in nadzorovanimi epruvetami. Metilensko modrilo služi obema namenoma, vendar nikoli v isti epruveti hkrati.