Članek
Metilensko modrilo v laboratorijskih testih G6PD: kaj barvilo dejansko počne
Študent po inkubaciji opazuje dve epruveti. V eni se je pojavila pričakovana barva. V drugi se ni. Študent sklene, da ima drugi bolnik pomanjkanje glukoza-6-fosfat dehidrogenaze. Ta sklep je morda pravilen, vendar pri takem razmišljanju izpusti načelo, na katerem temelji test. Nič v epruveti ne meri encima neposredno. V epruveti se meri tisto, kar encim proizvaja, pri čemer metilensko modrilo deluje kot posrednik.
Ko razumemo to posredno merjenje, postopek, kontrole in dolg seznam napačnih rezultatov niso več videti poljubni.
Kratek odgovor
Metilensko modrilo je pri testiranju G6PD redoksni indikator. Encim G6PD tvori NADPH, sistemi, odvisni od NADPH, pa reducirajo modro metilensko modrilo v njegovo brezbarvno levkoobliko oziroma ga uporabljajo za prenos elektronov. Pri normalni encimski aktivnosti je redukcija učinkovita. Pri zmanjšani aktivnosti je redukcija počasna ali nepopolna. To je celoten merilni signal.
Dve zgodovinski metodi uporabljata isto barvilo, vendar se razlikujeta po končnem odčitku. Če ju ločujemo, večina nejasnosti izgine.
Dva testa, eno barvilo, različna končna odčitka
Prvi je neposredni test redukcije metilenskega modrila, ki so ga opisali Sass in sodelavci, pozneje pa ovrednotil Gibbs. Pri njem je končni odčitek samo barvilo: oksidirano modro metilensko modrilo se reducira v brezbarvno levkometilensko modrilo, hitrost te spremembe pa odraža zmožnost tvorbe NADPH. Izvirni članek o presejalnem testu je indeksiran na PubMed pod Sass in sod. (1966).
Drugi je Brewerjev test redukcije methemoglobina. Natrijev nitrit najprej oksidira hemoglobin v rjavi methemoglobin. Metilensko modrilo nato deluje kot posrednik pri prenosu elektronov: reducirano metilensko modrilo prenese redukcijske ekvivalente na methemoglobin in ga pretvori nazaj v rdeči hemoglobin. Vidni končni odčitek je torej razlika med rjavo in rdečo barvo, ne med modro in brezbarvno. Izvirna metoda je bila objavljena v Biltenu Svetovne zdravstvene organizacije (Brewer in sod., 1960).
Poimenovanje Brewerjevega testa kot testa razbarvanja barvila je kemijsko nenatančno. Barvilo prehaja med oksidirano in reducirano obliko; barvo spreminja hemoglobin. Spodnji diagram prikazuje obe poti.
Reakcija, na kateri temelji test
G6PD katalizira prvi oksidacijski korak pentoznofosfatne poti:
Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+
Zreli eritrociti so za pridobivanje NADPH močno odvisni od te poti, kot opisujejo Luzzatto in sodelavci v reviji Blood (2020). NADPH ohranja glutation v reducirani obliki in ščiti celico pred oksidativnimi poškodbami. Metilensko modrilo se v ta sistem vključi kot akceptor elektronov. Zadostna aktivnost G6PD zagotavlja dovolj NADPH, ta pa omogoča učinkovito redukcijo. Nizka aktivnost G6PD prekine verigo že pri prvem členu.
Barvilo si predstavljajte kot merilnik goriva, ne kot motor. Poroča o razpoložljivosti NADPH. Vse drugo, kar spremeni to razpoložljivost ali odčitek, lahko premakne kazalec brez kakršne koli spremembe v genu.
Kako poteka postopek po Brewerjevem načelu
Sestava reagentov se je skozi desetletja spreminjala, zato učnega opisa ne smemo zamenjevati s kliničnim protokolom. Vsak laboratorij sledi svojemu validiranemu standardnemu operativnemu postopku. Ob tem opozorilu klasični postopek z epruvetami poteka takole; oblika s tremi epruvetami in 3-urno inkubacijo je dokumentirana v tem objavljenem izvedbenem postopku:
- Epruveta z bolnikovim vzorcem: polna kri z dodatkom glukoze, natrijevega nitrita in metilenskega modrila. Nitrit tvori methemoglobin, glukoza podpira presnovo eritrocitov, barvilo pa omogoča prenos elektronov, odvisen od NADPH.
- Oksidirana kontrola: kri z dodatkom nitrita in glukoze, vendar brez metilenskega modrila. Prikazuje rjavi končni odčitek methemoglobina, značilen za pomanjkanje.
- Hemoglobinska kontrola: kri z dodatkom vode. Prikazuje rdeči končni odčitek hemoglobina, značilen za normalno aktivnost.
- Inkubirajte vse epruvete pri približno 37 C, običajno 3 ure, in jih nežno premešajte.
- Razredčite majhen alikvot iz vsake epruvete z destilirano vodo, da lizirate celice in omogočite jasno primerjavo barv.
- Primerjajte epruveto z bolnikovim vzorcem z obema kontrolama. Premik proti rdeči barvi kaže na znatno redukcijsko zmogljivost. Vztrajanje rjave barve nakazuje izrazito pomanjkanje.
Ena od zgodovinskih sestav je uporabljala približno 1 mL krvi z reagenti s koncentracijami približno 180 mM natrijevega nitrita, 280 mM dekstroze in 0.4 mM metilenskega modrila. Te številke obravnavajte kot primer iz literature, ne kot univerzalno specifikacijo.
Odčitavanje rezultata
| Vzorec | Videz pri Brewerjevem testu | Pomen |
|---|---|---|
| Normalen | Epruveta z bolnikovim vzorcem se po barvi približa rdeči hemoglobinski kontroli | Redukcijska zmogljivost nad presejalnim pragom |
| Pomanjkanje | Epruveta z bolnikovim vzorcem ostane rjava, podobna methemoglobinski kontroli | Presejalni test nakazuje izrazito pomanjkanje G6PD |
| Vmesen | Barva je med obema kontrolama | Ne določajte fenotipa; aktivnost izmerite kvantitativno |
Kvalitativni presejalni test najbolje razlikuje rezultate pri približno 30 do 40 odstotkih normalne aktivnosti, kot je obravnavano v tem preglednem članku revije Malaria Journal o vrzelih pri odkrivanju pomanjkanja G6PD. Normalen presejalni rezultat zato pomeni, da test ni zaznal hudega pomanjkanja. Ne potrjuje povsem normalne aktivnosti.
Zakaj je presejanje lahko zavajajoče
Retikulocitoza po hemolizi je klasičen vzrok lažno normalnega rezultata. Mladi eritrociti in retikulociti vsebujejo več G6PD kot stare celice. Med akutno hemolitično epizodo so lahko najstarejše celice z največjim pomanjkanjem že uničene, zato ostane mlada populacija, pri kateri izmerjena aktivnost deluje normalna. Isti biološki pojav lahko zavede tudi kvantitativne teste, ne le presejalnih testov z barvilom.
Nedavna transfuzija prikrije pomanjkanje, ker darovalčevi eritrociti v vzorec prispevajo svoj encim. Mayo Clinic Laboratories navaja transfuzijo med vzroki nezanesljivih rezultatov encimskih meritev, poleg retikulocitoze in motenj zaradi levkocitov.
Heterozigotne ženske so najzahtevnejši primer. Naključna inaktivacija kromosoma X ustvari mešanico normalnih eritrocitov in eritrocitov s pomanjkanjem, skupna aktivnost pa je lahko kjer koli med izrazito zmanjšano in navidezno normalno. Kvalitativni presejalni testi pogosto ne zaznajo vmesnih fenotipov. Dokumentacija WHO o testiranju G6PD podrobno obravnava to omejitev.
Starost vzorca, temperatura shranjevanja, subjektivnost vizualnega končnega odčitka, hematokrit in kakovost reagentov tem biološkim vplivom dodajajo analitični šum.
Presejanje ni diagnoza
Presejalni rezultat, ki kaže pomanjkanje, je vmesen ali ni skladen s klinično sliko, zahteva kvantitativno meritev aktivnosti encima G6PD. WHO šteje kvantitativno spektrofotometrijo pri nadzorovani temperaturi za referenčni pristop. Pri tem testu se hemolizatu eritrocitov dodata glukoza-6-fosfat in NADP+, nastajanje NADPH pa se spremlja z naraščanjem absorbance pri 340 nm. Hitrost spremembe je sorazmerna encimski aktivnosti, ki je običajno preračunana na količino hemoglobina in izražena v enotah na gram. Trenutna kliničnolaboratorijska praksa je povzeta v vnosu za aktivnost G6PD v katalogu testov Mayo.
Pri interpretaciji se uporablja referenčni interval, ki ga je validiral laboratorij in je pogosto opredeljen glede na normalno aktivnost v populaciji; pomanjkanje se običajno obravnava pri pragu približno 30 odstotkov, vmesna aktivnost pa nad njim. Ciljni profili izdelkov WHO za teste G6PD (2022) določajo ta diagnostični okvir. Če je zaradi nedavne hemolize ali transfuzije določanje fenotipa nezanesljivo, je treba testiranje ponoviti, ko se populacija eritrocitov znova uravnovesi; molekularno testiranje lahko prispeva dodatne informacije, ne more pa nadomestiti meritve encimske aktivnosti.
Meja, ki jo je vredno ohraniti
Metilensko modrilo je v teh testih laboratorijski reagent ex vivo. To vprašanje je ločeno od varnosti dajanja metilenskega modrila bolniku, ki je obravnavana v smernicah o kontraindikacijah za metilensko modrilo. Biokemija ju povezuje, saj je tudi delovanje zdravila odvisno od redukcije, odvisne od NADPH, vendar barvilo v epruveti ni odmerek v krvnem obtoku. Za razumevanje obnašanja barvila pri obarvanju v drugačnih okoliščinah glejte načela obarvanja z metilenskim modrilom, za njegovo kemijsko skupino pa redoksna barvila v laboratoriju.
Presejanje preverja, ali je redukcijska zmogljivost videti ohranjena. Potrditveno testiranje ugotavlja, kolikšna je dejanska encimska aktivnost. Barvilo dobro odgovori na prvo vprašanje, če od njega nihče ne pričakuje odgovora na drugo.