Metilensko modrilo in vnetno signaliziranje: inflamasomi, IL-6 in STAT3

Predpostavimo, da trije laboratoriji poročajo, da ista modra spojina deluje protivnetno. Eden pokaže manj IL-1beta iz makrofagov. Drugi pokaže manj encima iNOS v istem tipu celic. Tretji pokaže manj IL-6 v krvi in manjšo aktivnost STAT3 v možganih. Mamljivo je vse tri rezultate združiti v eno trditev. Toda takšno združevanje zakrije ugotovitev.

Vsak rezultat pripada drugačnemu konceptu signaliziranja z lastnim sprožilcem, korakom sestavljanja in merjenim kazalnikom. Metilensko modrilo pri vsakem deluje na drugi točki. Ali karkoli od tega izboljša zdravstveni izid, je ločeno vprašanje, ki ga obravnavamo v našem pregledu metilenskega modrila in vnetja. Ta stran se osredotoča na signalne poti.

Pot 1: sestavljanje inflamasoma in kaspaza-1

Inflamasom je beljakovinsko ogrodje, ki se po potrebi sestavi v mieloidni celici. Njegovi deli so senzor, adapterska beljakovina ASC in efektorski encim kaspaza-1. Po sestavljanju kaspaza-1 cepi pro-IL-1beta in pro-IL-18 v obliki, ki se izločata, ter lahko sproži piroptozo, vnetno obliko celične smrti. Senzor določa tip: NLRP3 se odziva na kristale in toksine, ki tvorijo pore, kot sta nigericin in ATP, NLRC4 se odziva na bakterijski flagelin, AIM2 na citosolno dvoverižno DNA, nekanonična pot pa na znotrajcelični lipopolisaharid.

Za aktivacijo sta potrebna dva signala. Prvi signal je priprava: ligand receptorja, podobnega receptorju Toll, sproži od NF-kB odvisno transkripcijo NLRP3 in pro-IL-1beta, da so sestavni deli na voljo. Drugi signal je sestavljanje: drugi sprožilec povzroči oligomerizacijo ASC v skupke, cepitev kaspaze-1 v njen fragment p20 in sproščanje zrelega IL-1beta p17. Mitohondrijske reaktivne kisikove zvrsti in privzem kristalov so znani dejavniki, ki prispevajo k drugemu signalu pri NLRP3.

Študija širokega zaviranja inflamasomov v makrofagih iz leta 2017 je metilensko modrilo preizkusila pri obeh signalih. V makrofagih iz mišjega kostnega mozga, predhodno pripravljenih z lipopolisaharidom, so nigericin, ATP in kristali mononatrijevega urata vsak zase sprožili sproščanje IL-1beta in kaspaze-1 ter tvorbo skupkov ASC. Metilensko modrilo pri koncentracijah od 20 do 200 mikromolar je vse tri kazalnike zmanjšalo odvisno od odmerka, ne da bi ubilo celice. Flagelin in Salmonella za NLRC4, dvoverižna DNA in Listeria za AIM2 ter transfecirani lipopolisaharid ali žive E. coli za nekanonično pot so pokazali enak vzorec. Spojina sama ni sprožila sproščanja, kontrolne plošče pa niso pokazale protibakterijskega učinka, zato se rezultat nanaša na odziv gostitelja.

Na predhodnih stopnjah poti so izmerili tri učinke. Z metilenskim modrilom se je zmanjšala količina mitohondrijskega superoksida, ki ga je povzročil rotenon, skupaj z njo pa tudi sproščanje IL-1beta, ki ga je sprožil rotenon. Privzem fluorescentnih kroglic se je zmanjšal, kar je skladno z zmanjšano fagocitozo pred zaznavanjem kristalov. Poročevalski sistem pod nadzorom promotorja NLRP3 z dvema vezavnima mestoma za NF-kB je ob metilenskem modrilu pokazal manjšo aktivnost, skrajšani promotor brez teh mest pa se ni odzval. V epruveti brez celic je metilensko modrilo tudi neposredno zmanjšalo aktivnost rekombinantne človeške kaspaze-1. Dodajanje spojine samo med pripravo ali samo med aktivacijo je še vedno zmanjšalo sproščanje IL-1beta, IL-18 in kaspaze-1, zato sta vključena oba koraka.

Preizkusi na miših so bili skladni s to selektivnostjo. Smrtonosni odmerek lipopolisaharida je kontrolne živali ubil v nekaj urah, metilensko modrilo pa je izboljšalo preživetje; peritonealni IL-1beta se je zmanjšal, IL-6 v isti tekočini pa ne. V modelu peritonitisa, povzročenega z bakterijo Listeria, se je peritonealni IL-1beta zmanjšal, skupno število celic pa je ostalo nespremenjeno. Človeški monociti THP-1 so se pri vseh štirih tipih inflamasomov odzivali podobno kot mišji makrofagi. Rezultat, povezan z inflamasomom, pojasnjuje zorenje IL-1beta in IL-18, ne pa vsakega citokina. Zato tudi oblika imunskih celic v možganih v poskusih z mikroglijo in astrociti odgovarja na drugačno vprašanje kot sestavljanje ogrodja.

Pot 2: transkripcija iNOS prek vezave NF-kB in STAT1

Inducibilna sintaza dušikovega oksida oziroma iNOS je v mirovanju komaj prisotna, njena transkripcija pa se sproži po potrebi. Lipopolisaharid jo sproža predvsem prek razgradnje IkB-alpha, ki ji sledita fosforilacija NF-kB in njegov vstop v jedro. Interferon-gamma jo sproža predvsem prek fosforilacije STAT1 z Janusovo kinazo, čemur sledi vstop STAT1 v jedro. Vsak dejavnik se nato veže na svoje mesto na promotorju iNOS. Aktivnost encima in indukcija gena sta ločeni nadzorni točki, zdravilo pa lahko deluje na eni ali obeh.

Študija indukcije iNOS v makrofagih in miših z endotoksemijo iz leta 2015 je učinek umestila na raven informacijske RNA. V celicah RAW 264.7 in primarnih mišjih makrofagih je metilensko modrilo pri koncentraciji 1 mikromolar, dodano 30 minut pred lipopolisaharidom, interferonom-gamma ali obema, v obdobju od 8 do 24 ur zmanjšalo količino beljakovine iNOS in njene mRNA. Hkrati je bilo v gojišču manj nitrita, viabilnost celic pa se ni zmanjšala. Pri miših, ki so prejele 25 mg na kg lipopolisaharida, je enkratni odmerek 5 mg na kg eno uro prej zmanjšal količino beljakovine iNOS in njene mRNA v pljučih, jetrih in srcu.

Posebej pomembno je, kaj se ni spremenilo. Razgradnja IkB-alpha, fosforilacija NF-kB, fosforilacija STAT1 in kopičenje obeh dejavnikov v jedru so ostali nespremenjeni. Prekinitev je nastopila en korak pozneje: jedrni izvlečki so po lipopolisaharidu pokazali manjšo vezavo NF-kB na njegov element DNA, po interferonu-gamma pa manjšo vezavo STAT1. Imunoprecipitacija kromatina je potrdila manjšo zasedenost promotorja iNOS z obema dejavnikoma znotraj celic. Zmanjšala se je tudi količina dejavnika tumorske nekroze alfa, katerega promotor prav tako uporablja NF-kB. Dejavnika sta se aktivirala in prispela v jedro, vendar sta se slabo vezala na svojo tarčno DNA.

Upoštevajte razliko v primerjavi s potjo 1. Tu gre za vezavo dejavnika na DNA, vključen je STAT1 in ne STAT3, merjeni kazalniki pa so mRNA, beljakovina in nitrit, ne skupki ASC in fragmenti kaspaze-1. Naš zemljevid tarč metilenskega modrila v celičnih modelih to transkripcijsko raven obravnava ločeno od neposrednih encimskih in mitohondrijskih meritev.

Pot 3: serumski IL-6 in aktivacija STAT3 v tkivih

IL-6 prek družine receptorjev gp130 posreduje signal v kaskado od Janusove kinaze do STAT3. Fosforilirani STAT3 dimerizira, vstopi v jedro in sproža vnetne programe, sam IL-6 pa je tarča NF-kB. Tako tvorita povratno zanko, ki se pogosto imenuje os IL-6–STAT3. Standardni merjeni kazalniki so serumski IL-6 na predhodni stopnji, razmerje med fosforiliranim in celotnim STAT3 ter efektorski encimi, kot sta iNOS in COX2, na nadaljnjih stopnjah.

Študija IL-6 in STAT3 po lipopolisaharidu pri miših iz leta 2023 je to os merila v različnih bioloških predelih. Samci miši C57BL/6 so tri dni vsak dan prejemali 1 mg na kg lipopolisaharida, 30 minut po vsakem odmerku pa 5 ali 10 mg na kg metilenskega modrila. Tretji dan je bil serumski IL-6 v obeh skupinah z metilenskim modrilom nižji kot pri samem lipopolisaharidu, medtem ko se večina drugih citokinov v merjenem naboru ob obravnavi ni spremenila. Razmerja med fosforiliranim in celotnim STAT3 so bila nižja v možganski skorji, hipokampusu in koži uhlja, ob tem pa so opazili manjše barvanje mikroglije z označevalcem Iba-1, manj iNOS in COX2 ter delno zmanjšano izgubo telesne mase.

Tu sta potrebni dve opozorili. Nižji serumski IL-6 skupaj z manjšo fosforilacijo STAT3 v tkivih je skladen z modulacijo osi, vendar ne določa primarnega mesta delovanja. Manj citokina na predhodni stopnji, manj signaliziranja prek receptorjev ali spremenjena aktivnost fosfataz bi namreč lahko povzročili enako razmerje. Poleg tega je telesna masa v treh dneh akutnega izziva kazalnik na ravni celotne živali, ne ocena simptomov ali remisije. Doda kontekst, ki presega analizo z metodo blot, ne da bi rezultat signaliziranja spremenila v trditev o zdravljenju. Ločena kemija mitohondrijskih redoks procesov poteka vzporedno s tem citokinskim dogajanjem in je ne smemo združevati z njim.

Primerjava poti: mesta delovanja in merjeni kazalniki

Tabela preprečuje tri neveljavne prenose sklepov. Rezultat o skupkih ASC ne dokazuje rezultata o STAT3. Rezultat o vezavi STAT1 na promotor iNOS ne dokazuje rezultata o STAT3, čeprav obe beljakovini pripadata družini STAT. Rezultat o serumskem IL-6 ne dokazuje zmanjšanega sestavljanja inflamasoma: v peritonealnem poskusu se je IL-1beta zmanjšal, IL-6 pa ne. Vsaka vrstica potrebuje svoj sprožilec in merjeni kazalnik. Zato je treba pri branju celičnih, živalskih in kliničnih študij metilenskega modrila vsako trditev povezati z ravnjo, na kateri je bila izmerjena.

Nič od tega ne določa odmerjanja, varnosti ali koristi pri ljudeh. Modeli z lipopolisaharidom so nadzorovani sprožilci za preizkušanje mehanizma, ne posnetki kronične bolezni. Dajanje odmerka ob sprožilcu preizkuša preprečevanje izzvane spremembe, ne pa odpravljanja že razvite bolezni. To razlago mehanizmov obravnavajte ločeno od izidov pri bolnikih in vsako zdravstveno trditev presojajte na podlagi študije pri bolnikih, ki jo podpira.