Metilensko modrilo in ALS: zakaj se rezultati med eksperimentalnimi modeli razlikujejo

Če poiščete informacije o metilenskem modrilu in ALS, naletite na dve trditvi, ki si na videz nasprotujeta. Prva pravi, da je modro barvilo zaščitilo nevrone v modelih ALS. Druga pravi, da pri miši z ALS ni imelo učinka. Obe trditvi se sklicujeta na dejanske znanstvene članke in oba članka je vredno jemati resno. Navidezno protislovje izgine, ko opredelimo izhodišče posameznega poskusa: model določa, kaj lahko trdimo.

Rezultat pri črvu je trditev o črvu. Rezultat pri ribji ličinki je trditev o ribji ličinki. Nobeden ni trditev o bolniku, dokler tega ne podpre potek bolezni pri sesalcu. Ta članek vzporedno primerja dva najpogosteje citirana članka, da lahko vidite, zakaj se njuni odgovori razlikujejo.

Oba poskusa v eni tabeli

Med branjem imejte to tabelo pri roki. V njej so zajete vse pomembne razlike med raziskavama.

Razlikujejo se genetska osnova, vrste, pot dajanja, čas začetka in končni izidi. Genotip je le ena od petih razlik, zato ta dva poskusa ne moreta dokazati, da metilensko modrilo selektivno deluje na eno pot ALS. Dokazujeta nekaj ožjega, a še vedno uporabnega: izrazito izboljšanje ob zgodnji neposredni izpostavljenosti v preprostih modelih se ni preneslo v potek bolezni pri sesalcu ob dolgotrajnem peroralnem dajanju.

Pozitiven rezultat: kaj je pokazala raziskava pri črvih in ribah

V raziskavi pri črvih in ribah iz leta 2012 so v motoričnih nevronih črvov izražali mutirani človeški TDP-43 ali FUS, v ribje zarodke pa vbrizgali mutirano človeško mRNA. To so modeli proteotoksičnosti. V nekaj dneh poustvarijo toksične učinke mutirane beljakovine na gibanje in obliko nevronov, ne pa celotnega večletnega poteka ALS pri odraslem človeku.

Obravnava se je začela zelo zgodaj. Črvi so od izvalitve rasli na agarju, ki je vseboval metilensko modrilo. Ribji zarodki so bili čez noč v raztopini učinkovine, začenši 24 ur po oploditvi, vedenje pa so preizkusili približno dva dni pozneje. Med učinkovino in nevronom ni bilo krvno-možganske pregrade v takšni obliki kot pri sesalcu, koncentracije učinkovine v plazmi ali možganih pa niso merili.

V teh razmerah so bili učinki veliki in dosledni. Tako 6 kot 60 μM je zmanjšalo s starostjo povezano paralizo pri črvih s TDP-43 in FUS. Na 12. dan odraslosti je bilo paraliziranih približno 80 odstotkov neobravnavanih črvov s TDP-43, v primerjavi s približno 10 odstotki črvov, obravnavanih od izvalitve. Sinaptični preizkus je nakazoval enako: črvi s TDP-43 so bili preobčutljivi na aldikarb, učinkovino za preizkušanje živčno-mišičnega prenosa, metilensko modrilo pa je odziv pomaknilo nazaj proti normalnemu. Število degenerirajočih izrastkov motoričnih nevronov se je zmanjšalo, pri čemer je bil učinek najjasnejši pri 60 μM. Pri ribah se je plavanje, sproženo z dotikom, znatno izboljšalo, skrajšani motorični aksoni pa so pri 30 ali 60 μM znova zrasli proti normalni dolžini, čeprav je bilo izboljšanje delno in ne popolno.

Podatki o oksidativnem stresu so skladni z antioksidativno razlago. Črvi in ribe z mutacijami so imeli povišane kazalnike reaktivnih kisikovih zvrsti, ki so se ob obravnavi znižali, normalni črvi na metilenskem modrilu pa so ob izpostavljenosti prooksidantu preživeli precej dlje kot neobravnavani črvi. Vendar sta pomembni dve omejitvi. Skupne ravni mutiranih beljakovin TDP-43 in FUS se niso znižale, raziskava pa ni neposredno količinsko opredelila beljakovinskih agregatov, zato kaže izboljšanje delovanja, ne da bi dokazala odstranjevanje agregatov. Kdor spremlja, kako se običajno predstavljajo redoksne in mitohondrijske hipoteze, naj mehanizem obravnava kot podprt, vendar še ne dokončno pojasnjen.

Najbolj povedna podrobnost je bil čas začetka. Ko so avtorji z začetkom obravnave počakali do 5. dne odraslosti, je bila stopnja paralize na 12. dan približno 55 odstotkov, namesto približno 10 odstotkov pri obravnavi od izvalitve. Ista učinkovina, isti črv, ista mutacija, precej manjši učinek. Zgodnja preventivna izpostavljenost je prispevala velik del opažene koristi.

Ničelni rezultat: kaj je pokazala raziskava pri miših s SOD1

Raziskava pri miših iz leta 2011 je postavila zahtevnejše vprašanje v strožjem sistemu. Pri kongenih miših s SOD1 G93A bolezen napreduje od tresenja zadnjih okončin prek motenj hoje in izgube refleksa obračanja v normalen položaj do vnaprej opredeljenega končnega izida. Obravnava se je začela pred pojavom simptomov na 45. dan in se nadaljevala vsak dan, opazovalci pa so nevrološko stanje ocenjevali na lestvici od 0 do 6. To je poskus, ki zajema celoten potek bolezni, zato je bližje temu, kar bi bilo pomembno za bolnika, kot katera koli krivulja paralize pri črvu.

Glavni rezultati niso pokazali učinka. V celotni skupini so se simptomi pojavili pri 121 dneh pri kontrolnih živalih in pri 124 dneh ob metilenskem modrilu; razlika ni bila statistično značilna. Preživetje do končnega stadija je bilo 167 dni v primerjavi s 170 dnevi, prav tako brez statistično značilne razlike. Nekaj sekundarnih analiz je govorilo v prid obravnavi: pri samicah se je pojav simptomov zamaknil za približno 7 dni, obravnavane živali pa so nekoliko več časa preživele v blažjih stadijih in manj v težjih. Zaradi majhnih podskupin po spolu in številnih primerjav med stadiji so ti rezultati bolj podlaga za oblikovanje hipotez kot dokaz. Niso merili števila nevronov, agregacije SOD1 niti oksidativnih ali vnetnih označevalcev, zato raziskava tudi ne more povedati, ali je učinkovina dosegla svoje tarče in bila neuspešna ali pa pri tem odmerku nanje sploh ni delovala. Preizkusili so le en odmerek.

Avtorji so sami opozorili na najglobljo omejitev, ki velja v obe smeri. Model SOD1 G93A z velikim številom kopij dobro ponazarja bolezen zaradi toksičnega SOD1, vendar ta predstavlja majhen delež družinske ALS in se biološko razlikuje od večine sporadičnih primerov. Predlagali so ponovno preizkušanje kandidatnih učinkovin v modelih sesalcev, ki temeljijo na TDP-43. Ta predlog je odtlej postal bolj zapleten, saj avtorji raziskave pri črvih in ribah navajajo, da tudi ločena raziskava metilenskega modrila pri miših s TDP-43 ni izboljšala motoričnih izidov. Spojina se torej lahko v enem sistemu TDP-43 izkaže kot zelo učinkovita, v drugem sistemu TDP-43 pa je brez učinka. Sistem je enako pomemben kot gen.

Zakaj izboljšanje pri črvu ali ribi ne more potrditi koristi pri bolnikih

Vsak model obravnavajte kot odgovor na drugačno vprašanje.

Prvič, biologija se razlikuje. TDP-43 in FUS sta beljakovini, ki vežeta nukleinske kisline in imata v teh preprostih sistemih skupne genetske interakcije, medtem ko toksičnost SOD1 poteka prek deloma drugačnih neposrednih mehanizmov. Učinkovina, ki ublaži eno obliko proteotoksičnega stresa, ne ublaži nujno druge, uspeh pri čezmernem izražanju v zarodku pa ne napoveduje nujno uspeha pri počasni nevrodegeneraciji v odraslosti, ki vključuje vnetje, sodelovanje glije in sistemsko pešanje.

Drugič, izpostavljenost se razlikuje. Stalna izpostavljenost v raztopini pri mikromolarnih koncentracijah ni isto kot peroralno dajanje. Med zaužitim odmerkom in motoričnim nevronom v hrbtenjači so črevesna absorpcija, presnova prvega prehoda, vezava na plazemske beljakovine, prehajanje v možgane in očistek. Nobena raziskava ni merila koncentracij učinkovine v živčnem sistemu, zato nobena ne more povezati svoje koncentracije s koncentracijo v drugi raziskavi.

Tretjič, čas začetka se razlikuje. Koristi pri črvih in ribah so bile močno odvisne od obravnave pred kopičenjem patoloških sprememb. Tudi obravnava miši se je začela pred pojavom simptomov, kar je prednost, vendar bi se zdravljenje pri ljudeh skoraj vedno začelo po pojavu simptomov, torej še pozneje. Preventivni signal v preizkusu z dva dni starimi zarodki je izhodišče za raziskovanje, ne model klinične uporabe.

Četrtič, končni izidi se razlikujejo. Paraliza pri 12 dneh, občutljivost na aldikarb, dolžina aksonov v mikrometrih in preplavana razdalja so neposredni fenotipski kazalniki. Pojav simptomov in preživetje pri sesalcu združujeta vse kompenzacijske procese in procese, ki zapletajo potek v telesu. Učinkovine pogosto spremenijo neposredne kazalnike, ne da bi spremenile preživetje, zato pri sesalcih uporabljamo končne izide, ki merijo čas do dogodka.

Bralci, ki želijo kontrolni seznam za naslednji odmevni naslov, si ga lahko izposodijo iz članka o tem, kako brati predklinične raziskave: vprašajte se, za katero vrsto in transgen gre, kakšna sta odmerek in pot dajanja, ali so merili koncentracije učinkovine, kdaj se je obravnava začela glede na patološke spremembe, ali je bil končni izid kratkoročni fenotip ali potek bolezni in ali so učinek ponovili v drugem laboratoriju. Širši nabor dokazov o metilenskem modrilu pri ljudeh ostaja mesto za preverjanje, ali je kateri od teh zgodnjih signalov prerasel v klinične podatke.

Kaj to pomeni za bolnike in družine

Iz teh člankov ne izhaja noben uveljavljen protokol uporabe metilenskega modrila pri ALS. Pozitivna raziskava podpira nadaljnje raziskovanje oksidativnih in sinaptičnih mehanizmov v biologiji TDP-43 in FUS. Raziskava brez učinka govori proti pričakovanju, da bi dolgotrajno peroralno dajanje pri tej izpostavljenosti spremenilo potek bolezni tipa SOD1. Skupaj opisujeta neskladnost med modeli, ne priporočila za zdravljenje.

Varnost zahteva enako trezno obravnavo kot učinkovitost. Raziskave ALS pri miših ne povedo ničesar o varnem odmerjanju pri ljudeh, metilensko modrilo pa prinaša dejanska tveganja zaradi hemolize pri pomanjkanju G6PD in serotoninske toksičnosti ob kombiniranju s serotonergičnimi zdravili. Sum na pomanjkanje G6PD, trenutna uporaba antidepresivov in vsaka načrtovana sprememba zdravil sodijo v pogovor z zdravnikom, prav tako pregled splošnih podatkov o varnosti metilenskega modrila, preden kdo ukrepa na podlagi odmevnih laboratorijskih ugotovitev.

Bistvo lahko povzamemo v enem stavku. Metilensko modrilo je ob zgodnji izpostavljenosti izrazito izboljšalo fenotipe pri črvih in ribjih ličinkah s TDP-43 in FUS, v raziskavi pri miših s SOD1 ob dolgotrajnem peroralnem dajanju pa praktično ni prineslo koristi glede pojava simptomov ali preživetja, zato je poštena razlaga, da gre za dokaze, odvisne od modela, ki ne podpirajo uporabe pri bolnikih.