Kdo je razvil vijolično barvanje krvi? Metilensko modrilo, Malachowski, Romanowsky in Giemsa

Eozin je rdeč. Metilensko modrilo je modro. Zmešajte ju, mešanico nanesite na posušen krvni razmaz in nekateri deli razmaza se obarvajo vijolično.

Ne vsi deli. V dobrem preparatu se jedra belih krvničk obarvajo rdečevijolično, znotraj malarijskega zajedavca pa enako barvo dobi kromatin, medtem ko okoliške rdeče krvničke ostanejo rožnate, citoplazma pa sivomodra. Prav vijolična barva omogoča razlikovanje med vrstami celic.

Nobena od stekleničk ne vsebuje vijolične barve. Ta se pojavi šele, ko določen razgradni produkt metilenskega modrila na objektnem stekelcu pride v stik z eozinom. V osemdesetih in devetdesetih letih 19. stoletja pa nihče ni vedel, da ta produkt sploh obstaja, kaj šele, kaj je. Ljudje, ki so iskali to barvo, so delali z nečistimi barvili, vsak zase in brez zanesljivega načina, da bi ugotovili, kaj je v steklenički, potem ko je dva meseca stala na polici.

Zato ima vprašanje iz naslova več kot en utemeljen odgovor in zato se je odgovor leta 2011 spremenil.

Vidni rezultati, ki so se spreminjali z mešanico

Barvanje ni nastalo z enim samim izumom. Razvijalo se je postopoma. Vsaka sprememba mešanice je razkrila natanko eno novo vidno podrobnost, njihovo zaporedje pa je najjasnejši način za razumevanje te zgodovine.

Pomemben je vzorec v zadnjem stolpcu. Vsak napredek je razširil barvno paleto, vsaka razširitev pa je razkrila še eno strukturo. Vijolična barva ni okras te tehnike; pomeni razliko med tem, da vidimo prisotnost zajedavca, in tem, da vidimo, iz česa je sestavljen. Kako je samo barvilo iz tovarne barvil BASF prišlo v medicino, je daljša zgodba z lastnimi dokumentarnimi viri. Celotno zgornje zaporedje z virom za vsak vnos je zbrano v časovnem pregledu prispevkov s povezavami do virov.

Slika: istih šest mešanic, prikazanih glede na to, kaj je bilo v posodi in kaj je iz nje nastalo. Krogi prikazujejo barvila, pravokotniki pod njimi pa barve, ki so jih ta barvila lahko ustvarila v krvnem razmazu. Pred letom 1890 ni nikjer rdečevijoličnega pravokotnika, po njem pa ne manjka nikjer.

Mož, ki je boraks uporabil namenoma

Ernst Malachowski je bil zdravnik v Breslauu, današnjem Wrocławu. Svojo poklicno pot je preživel v zasebni praksi in majhni kliniki, ki jo je vodil s kolegom, laboratorijsko delo pa je opravljal v prostem času. Rodil se je v Strzelnu 12. marca 1857, študiral medicino na Univerzi v Breslauu in od leta 1882 do 1887 delal kot asistent interne medicine v bolnišnici Vseh svetih, tedaj drugi največji bolnišnici v Nemčiji.

Leta 1888 je začel z dvojnim barvanjem po Chęcińskem in Plehnu. V preparatu, pripravljenem leta 1889, je opazil, da se kromatin jedra plazmodija obarva drugače kot citoplazma, nato pa ugotovil, da rezultata ne more ponoviti. Poskusil je zakisati metilensko modrilo, kar je stanje poslabšalo. Poskusil ga je alkalizirati z boraksom, kar je delovalo vsakič. Metodo je javno prikazal 15. junija 1890, avgusta 1891 pa objavil podrobnejši opis, vključno z navodilom za uporabo boraksa. Zapisal je, da barvanje traja štiriindvajset ur in da so rezultati zlahka ponovljivi.

Štiriindvajset ur je v diagnostičnem laboratoriju dolga doba, njegov članek pa se ni podrobneje posvetil vijoličnordeči barvi jedra zajedavca. Ne glede na razlog nihče ni prevzel namernega alkaliziranja metilenskega modrila, dokler tega ni leta 1898 znova storil Nocht. Malachowski o barvanju krvi ni nikoli več pisal.

Razlog, da je bilo do nedavnega o njem znanega tako malo, je arhivski, ne skrivnosten. V medicinski literaturi ni ostala skoraj nobena sled njegovega življenja, tisto, kar se je ohranilo, pa je do nas prišlo po eni poti. Njegova hči Marie je leta 1939 iz Nemčije odšla v London, služila v britanski vojski in se naselila v Kanadi, njena zbirka družinskih dokumentov pa je pristala na Inštitutu Lea Baecka v New Yorku. Njen brat Leo je padel v prvi svetovni vojni. Njeno sestro Evo so aprila 1942 iz Breslaua deportirali v prehodno taborišče Izbica in nikoli se ni vrnila. Njena mati Hedwig si je 22. aprila 1942 vzela življenje, da ji ne bi bilo treba čakati na enako deportacijo. Malachowski je umrl leta 1934, pred vsem tem.

Družinska zgodovina, ki se tako konča, je družinska zgodovina, ki jo nehajo navajati. Članka, ki sta Malachowskega znova umestila v razvoj tega barvanja, oba objavljena leta 2011, sta nastala na podlagi arhivskih dokumentov v Poznanju in Wrocławu ter Mariejinih dokumentov v New Yorku.

Plesniva steklenička in srečni Rus

Dmitri Romanowsky je študiral medicino na Vojaški medicinski akademiji v Sankt Peterburgu in se večino svoje poklicne poti ukvarjal z malarijo. Leta 1890 je objavil metodo, ki je bila na papirju skoraj enaka metodi Chęcińskega: nespremenjeno metilensko modrilo in eozin, z nekoliko več eozina.

Septembra 1891 je objavil metodo, ki mu je prinesla slavo, pomembna podrobnost pa je bila zakopana med navodili. Najboljše rezultate je dosegel z založno raztopino metilenskega modrila, ki je stala več kot dva meseca in na kateri je rasla plesen. Zaradi plesni in dolgega stanja se je barvilo delno demetiliralo. Romanowsky tega ni vedel in tega ni mogel nadzorovati, drugi raziskovalci, ki so preizkusili njegovo metodo, pa niso mogli dobiti vijolične barve. Svojo disertacijo je v Sankt Peterburgu oddal junija 1891, zato običajna zgodovinska razlaga leto 1891 navaja kot leto odkritja.

Malachowski je metodo prikazal junija 1890, več kot leto prej, njegova metoda pa je delovala načrtno.

Zakaj je poimenovanje pripadlo napačnemu človeku

Argumente v prid Malachowskemu so zbrali Kristine Krafts, Ernst Hempelmann in Barbara Oleksyn, temeljijo pa na štirih stvareh. Datumu javnega prikaza: junij 1890 proti septembru 1891. Besedi namerno proti besedi naključno. Dejstvu, da je Malachowski objavil svojo metodo, z boraksom vred, medtem ko je bila metoda Romanowskega odvisna od nenadzorovane spremenljivke. In opažanju, da je opis jedra plazmodija skupaj z vijolično barvo, ki ga je razkrila, za sedem let praktično izginil iz literature, ker nihče ni mogel ponoviti naključne različice.

Pri sklepu ne ovinkarijo. V biografskem članku pripisovanje zaslug označijo za »izkrivljanje« in navedejo Ralpha Lillieja, ki je leta 1978 zapisal, da »bi morda morali to družino barvil imenovati barvila po Malachowskem«.

Trditev je sporna, kot so trditve o prvenstvu običajno, in naravo spora je vredno pojasniti, ne pa razrešiti. Razprava o prvenstvu mora povedati, kaj je bilo odkrito. Če je odkritje vijolična barva, ima Malachowski zgodnejši dokumentirani prikaz. Če je odkritje objavljena metoda, sta oba objavila leta 1891, poimenovanje pa je pripadlo Romanowskemu. Če je odkritje razlaga, si prvenstva ne more lastiti nobeden, saj nobeden ni vedel, da je zorenje demetilacija, in nobeden ni znal povedati, zakaj se barva sploh pojavi. Prav zadnjo točko poljudni prikazi preskočijo. Aktivna sestavina je bila nečistota, ki je nihče ni identificiral, prvi človek, ki je barvo ustvaril namerno, pa je to storil na podlagi ponovljivega empiričnega recepta, ne razumevanja njegovega delovanja.

Članka iz leta 2011 sta najcelovitejša objavljena predstavitev argumentov v prid Malachowskemu, oba pa sta brezplačno dostopna prek PubMed: obsežni pregledni članek pri PMID 21235291 in biografski članek pri PMID 21660627. Zapis preglednega članka v PubMed navaja tudi komentar nanj, objavljen pozneje istega leta v isti reviji pri 86(5):366, kar je ustrezen opomnik, da je bila argumentacija v tisku izpodbijana takoj po objavi.

Spor pa ni nesoglasje o kemiji. Vsi vpleteni se strinjajo o tem, kaj je vijolična barva in katere sestavine jo ustvarijo. Nesoglasje se nanaša na to, kdo je do nje prišel prvi, in na to, ali naključje, ki ga nihče ni mogel ponoviti, sploh šteje kot dosežek.

Kaj so prispevala poznejša imena

Če je Malachowski prvi ustvaril vijolično barvo, zakaj barvilo nosi imena Romanowskega, Wrighta in Giemse?

Ker barvilo, ki enkrat deluje v rokah svojega izumitelja, še ni reagent. Poznejše delo je muhasto mešanico spremenilo v nekaj, kar je lahko tehnik v drugi državi uporabil na katerikoli torek.

Nocht je do rešitve prišel z razmislekom. Ko s preprostim nevtralnim barvilom ni mogel dobiti zanesljivega rezultata, je sklenil, da mora vijolična barva izvirati iz nečesa v metilenskem modrilu, kar ni metilensko modrilo, in začel to iskati. Unna je že opazil, da postarane raztopine metilenskega modrila zrnca mastocitov obarvajo rdeče, ter predlagal, da med zorenjem barvila nastane nova snov. Bernthsen je leta 1885 pokazal, da alkalni pogoji z metilenskega modrila odstranijo metilne skupine in da so ti produkti tisto, kar danes imenujemo azuri. Nocht je aktivno frakcijo ekstrahiral s kloroformom in jo lahko poimenoval le rdeča iz metilenskega modrila; Michaelis jo je leta 1901 poimenoval azur I. Jenner je rešil logistiko. S ponovnim raztapljanjem oborine metilenskega modrila in eozina v absolutnem metanolu je dobil eno samo stabilno raztopino, ki je razmaz med barvanjem tudi fiksirala in odpravila potrebo po toplotni fiksaciji. Leishman in Reuter sta polikromirano barvilo združila z alkoholnim topilom ter tako hkrati dosegla stabilnost in vijolično barvo. Wright je dvanajsturno inkubacijo pri 65 °C in deset dni stanja nadomestil z eno uro v toku pare. Giemsa se je povsem prenehal zanašati na naključno dozorelo raztopino in je uporabil odmerjene količine znanih barvil z glicerolom v metanolu, da je izdelek zdržal tropsko vročino. Nikoli ni objavil, kako je izdeloval čisti metilenski azur. Prodajal ga je laboratoriju dr. Grüblerja v Leipzigu, ki ga je tržil kot azur I in trdil, da je samo njegova različica pristno barvilo po Giemsi.

O identiteti tega azura še vedno razpravljajo. Nekateri menijo, da je šlo preprosto za polikromirano metilensko modrilo, drugi pa, da je vsebovalo veliko Azure B. Odgovor je prinesla vojna. Ko nemških barvil ni bilo več mogoče dobiti, je skupina ameriške službe za javno zdravje, Ralph Lillie z Mauriceom Roejem in Aimee Wilcox, ugotovila, da najboljše barvanje omogočajo tri ločene sestavine: nespremenjeno metilensko modrilo, njegov demetilirani razgradni produkt Azure B in eozin. Azure B je nadomestil nedostopni azur I in te tri sestavine so še danes osnova barvila, ki se uporablja za diagnosticiranje malarije.

Kemija medsebojnega delovanja teh treh sestavin na objektnem stekelcu je ločeno vprašanje in tema druge strani. Stran o vlogah barvil in kemiji barvanj tipa Romanowsky pojasnjuje, kaj počneta Azure B in eozin ter zakaj skupaj ustvarita barvo, ki je nobeden ne ustvari sam. Stran o mikroskopiji in laboratorijskih uporabah pa obravnava praktično plat: kaj pokaže posamezen preparat in kako presoditi, ali je določen izdelek primeren za metodo, ki jo nameravate uporabiti.

Del zgodovine, ki je še vedno aktualen

Ena podrobnost te zgodbe je ostala resnična tudi po letu 1902. Približno petdeset let je bila najpomembnejša sestavina svetovno standardnega barvila za malarijo neimenovana nečistota. Prisotna je bila po naključju, njena količina se je med stekleničkami razlikovala, njena identiteta je bila del tega časa poslovna skrivnost, o njenem deležu pa so razpravljali vse do štiridesetih let 20. stoletja. Ljudje, ki so barvilo uporabljali, niso bili malomarni. Niso imeli možnosti vedeti, kaj je v steklenički.

Sodobna različica iste težave je specifikacija, ki opisuje le del materiala. Skladnost z USP je pot do najvišje čistosti, ki jo ponuja trg, saj gre za celovit objavljen standard, ne za eno samo meritev: identiteta, čistost, organske nečistote, vključno z azurnimi barvili, preostala topila, elementne nečistote, žarilni ostanek, mikrobiološke mejne vrednosti in bakterijski endotoksini. Blupreme svoje metilensko modrilo pridobiva od farmacevtskega proizvajalca in objavlja celoten certifikat analize, tako da je mogoče vsako postavko tega seznama preveriti, ne zgolj zatrjevati. Certifikat, ki navaja rezultat za težke kovine in to označi kot skladnost z USP, je današnji ekvivalent stekleničke z oznako »dozorelo metilensko modrilo«: morda odličen reagent, vendar oznaka ne pove, kaj je v njem.