Metylénová modrá vo výskume mozgovej príhody a cerebrálnej hypoperfúzie: čo skutočne ukazujú tri modely

Upchatá tepna, bunková kultúra bez živín a potkan so zúženými krčnými tepnami znejú ako tri verzie jedného experimentu. Nie sú. Každý kladie inú otázku a metylénová modrá v každom poskytuje inú odpoveď. Ak ich zamieňame, odborná literatúra pôsobí rozporuplne. Ak ich oddelíme, objaví sa jasný vzorec, ktorý určuje najmä načasovanie.

Práve toto rozlíšenie je hlavným zmyslom tohto prehľadu. Ide o tri modely: akútnu ložiskovú mozgovú príhodu, depriváciu kyslíka a glukózy s následnou reoxygenáciou v kultivovaných bunkách a chronickú cerebrálnu hypoperfúziu trvajúcu týždne. Navrhovaný mechanizmus, ktorý ich spája, je mitochondriálny, no výsledky sa líšia, pretože sa líši metabolický kontext.

Tri modely odpovedajú na rôzne otázky

Akútna ložisková mozgová príhoda sa u potkanov zvyčajne vyvoláva oklúziou strednej mozgovej tepny, označovanou skratkou MCAO. Uzáver podobný krvnej zrazenine vytvorí ischemické jadro obklopené penumbrou, teda tkanivom, ktoré je ohrozené, ale pri obnovení prietoku ho možno potenciálne zachrániť. Otázkou je, či zásah spomaľuje rast infarktu alebo zachováva funkciu v období reperfúzie.

Deprivácia kyslíka a glukózy, označovaná skratkou OGD, prebieha na opačnej úrovni. Kultivované mozgové bunky sa umiestnia do prostredia s takmer nulovým obsahom kyslíka a bez glukózy a potom sa vrátia do normálneho média. Nie je tu zrazenina, kolaterálny krvný obeh, krvný tlak ani imunitný systém. Otázka je čisto bunková: čo sa stane s bunkovým dýchaním, ATP a prežívaním, keď substráty zmiznú a potom sa vrátia.

Pri chronickej cerebrálnej hypoperfúzii sa používa trvalá obojstranná oklúzia krčných tepien u potkanov, nazývaná model 2VO. Prietok krvi do predného mozgu klesá a zostáva nízky celé týždne. Nedochádza k náhlemu ložiskovému infarktu ani k urgentnej reperfúzii. Otázkou je, či týždne metabolickej podpory zachovávajú cievy, mitochondrie a pamäť počas dlhodobo zníženého prietoku.

Zlepšenie pamäti po jednom mesiaci liečby v modeli 2VO preto priamo nič nehovorí o záchrane ľudského mozgu pri urgentnej trombektómii. Toto rozlíšenie je dôležité, pretože väčšina optimistických zhrnutí ho vynecháva.

Akútna mozgová príhoda: ochrana pri reperfúzii, oddialenie bez nej

Najjasnejší výsledok pri akútnej príhode pochádza z prechodnej MCAO s reperfúziou. Potkany podstúpili 60 minút oklúzie a potom dostávali nízku dávku metylénovej modrej intravenózne, pričom podávanie sa začalo pri reperfúzii a ďalšie dávky nasledovali po 3 hodinách a na 2. deň. MRI ukázala, že do 2. dňa sa lézia v skupine, ktorá dostávala nosný roztok, zväčšila približne o 19 percent, zatiaľ čo v liečenej skupine sa zmenšila približne o 17 percent. Konečné infarkty boli približne o 30 percent menšie a neurologické skóre bolo na 2. a 7. deň lepšie. Zobrazovanie ukázalo lepšie prežívanie tkaniva v jadre aj v penumbre. Širšia literatúra o neuroprotekcii zaraďuje túto ochranu načasovanú na reperfúziu popri nálezoch pri globálnej ischémii a traume.

Situácia sa mení, keď tepna zostáva upchatá. V experimente s trvalou MCAO metylénová modrá podaná počas prebiehajúcej ischémie spomalila zväčšovanie lézie na difúznom zobrazení a krátkodobo predĺžila nesúlad medzi perfúznym a difúznym zobrazením, pričom miestny prietok bol mierne lepší. Konečný objem infarktu po 24 hodinách sa však významne nelíšil. Oddialila premenu ohrozeného tkaniva na infarkt, no nenahradila opätovné otvorenie cievy.

Tretia akútna štúdia dopĺňa podrobnosti o mechanizme a dávke. Jednorazová intraperitoneálna dávka podaná bezprostredne po oklúzii priniesla najväčšie zmenšenie infarktu, približne o 50 percent, pri strednej dávke 5 mg/kg, nie pri 1 alebo 10 mg/kg, spolu s lepším senzomotorickým skóre. Autori to spájali so zachovanou štruktúrou mitochondrií a zvýšenou mitofágiou, teda selektívnym odstraňovaním poškodených mitochondrií. Dávka, spôsob podania a časový režim sú preto dôležité a hodnoty v mg/kg u potkanov nie sú dávkami na liečbu mozgovej príhody u ľudí.

Bunková kultúra: tá istá látka pomáha alebo škodí podľa toho, kedy sa podá

Experiment s astrocytmi je najpoučnejší a zároveň najčastejšie nesprávne citovaný. Primárne kortikálne astrocyty myší podstúpili 6 hodín závažnej deprivácie pri 0.1 percenta kyslíka v médiu bez glukózy, pyruvátu alebo séra. Nasledovalo 24 hodín reoxygenácie s obnovenými substrátmi. Približne polovica buniek odumrela, takže test umožňoval zachytiť účinok v oboch smeroch.

Keď bola metylénová modrá prítomná počas fázy deprivácie, prežívanie sa zhoršilo, nie zlepšilo. Keď sa namiesto toho pridala pri reoxygenácii, nízke mikromolárne koncentrácie zlepšili životaschopnosť a zvýšili spotrebu kyslíka, príjem glukózy a tvorbu ATP. Za normálnych podmienok tie isté koncentrácie zvýšili príjem glukózy približne o 89 percent pri 0.1 mikromólu na liter a približne o 200 percent pri 1 mikromóle na liter. Po poškodení sa zachoval glykogén aj aktivita hexokinázy a nezistilo sa zvýšenie superoxidu.

Mechanizmus sa dá ľahšie pochopiť pomocou prirovnania k záložnému generátoru. Metylénová modrá pôsobí ako alternatívny prenášač elektrónov, ktorý prijíma redukčné ekvivalenty a odovzdáva ich smerom k cytochrómu c a komplexu IV. Tým podporuje tok elektrónov a syntézu ATP a zároveň znižuje únik elektrónov v predchádzajúcich úsekoch reťazca. Počas závažnej deprivácie je táto stimulácia nevýhodou, pretože zvyšuje metabolické nároky v čase, keď kyslík a glukóza takmer chýbajú, čo môže rýchlejšie vyčerpať posledné rezervy. Po návrate substrátov sa tá istá vlastnosť stáva výhodou, pretože pomáha poškodeným mitochondriám účinne využívať znovu dostupný kyslík a glukózu. Aj preto treba zistenia z textov vysvetľujúcich mitochondriálny prenos elektrónov uvádzať spolu s kontextom deprivácie.

Jedno upozornenie: toto pravidlo načasovania platí pre danú prípravu astrocytov. Súvisiaca bunková štúdia s iným typom buniek, miernejšou depriváciou a nižšou koncentráciou zistila ochranu aj pri expozícii počas deprivácie. O tom, či je účinok priaznivý alebo nepriaznivý, rozhodujú typ buniek, zvyškový kyslík, koncentrácia a protokol.

Chronicky znížený prietok: pamäť, cytochrómoxidáza a cievy počas týždňov

V chronických experimentoch sa používala každodenná liečba nízkou dávkou počas týždňov, nie jednorazový urgentný bolus. V prvej štúdii dostávali potkany s trvalou oklúziou krčných tepien 4 mg/kg denne počas jedného mesiaca. Podanie bolo načasované po každom dennom tréningu, aby sa zameralo na konsolidáciu pamäti, nie na okamžitý výkon. Zvieratá s oklúziou sa úlohy vizuálneho rozlišovania učili pomalšie a dosahovali horšie výsledky v náročnom pamäťovom teste, zatiaľ čo schopnosť plávať, motorická aktivita a rozpoznávanie pachov neboli ovplyvnené. Každodenná liečba zmiernila poruchy učenia a pamäti bez zmeny celkového motorického správania.

Nadväzujúca štúdia zmapovala cytochrómoxidázu, ktorá je mitochondriálnym komplexom IV, v 44 oblastiach mozgu po rovnakom jednomesačnom režime. Oklúzia znížila aktivitu enzýmu vo zrakovej, prefrontálnej a peririnálnej kôre, ako aj v hipokampe a amygdale, a oslabila koordinovanú aktivitu medzi zrakovou kôrou a hipokampom. Liečba zachovala regionálnu aktivitu enzýmu a posilnila tieto medziregionálne metabolické korelácie, pričom zachovaná aktivita korelovala s lepším výkonom v úlohách. Tieto korelácie opisujú koordinovanú aktivitu metabolického enzýmu, nie priame merania funkčnej konektivity u ľudí. Toto rozlíšenie pomáhajú objasniť prehľady energetického metabolizmu mozgu.

Samostatná týždňová štúdia používala 2 mg/kg denne a pridala inhibítor signálnej dráhy na overenie mechanizmu. Pri liečbe sa prietok krvi mozgom zvýšil približne zo 60 na približne 100 mL na 100 g za minútu a hustota ciev v hipokampe vzrástla približne z 15.1 na 23 percent. Oba prínosy sa čiastočne zvrátili pri zablokovaní dráhy prežívania buniek PI3K/Akt a pri liečbe sa zvýšila hladina fosforylovanej Akt. Nálezy týkajúce sa prietoku krvi, hustoty ciev, bariéry a neurónov poukazujú na neurovaskulárnu ochranu spojenú so signalizáciou PI3K/Akt, nie na čisto metabolický účinok.

Prečo nič z toho nie je urgentnou liečbou mozgovej príhody

Dôvodom, prečo sa tieto výsledky nedajú priamo preniesť do praxe, sú kontrolované laboratórne podmienky. Kultivované bunky nemajú trombus ani farmakokinetiku. Model 2VO predstavuje dlhodobo znížený globálny prietok, nie náhly ložiskový embolus s penumbrou vzniknutou pred niekoľkými minútami. Aj MCAO u potkanov využíva mladé zdravé zvieratá, anestéziu, jednotné oklúzie a presne načasované podávanie, na rozdiel od starších pacientov s rôznymi zrazeninami, aterosklerózou, hypertenziou, cukrovkou a neznámym časom vzniku príznakov.

Žiadna publikovaná randomizovaná štúdia u ľudí nepotvrdila metylénovú modrú ako urgentnú liečbu akútnej ischemickej mozgovej príhody. Niekedy citovaná zobrazovacia štúdia u ľudí zahŕňala 26 zdravých dospelých, nie pacientov s mozgovou príhodou, a jednorazová perorálna dávka zmenila mozgové signály súvisiace s úlohami s malým zlepšením vybavovania z pamäti. To dokazuje aktivitu v centrálnom nervovom systéme, nie účinnosť pri mozgovej príhode. Súčasné odporúčania pre urgentnú starostlivosť sa namiesto toho sústreďujú na rýchlu reperfúziu pomocou intravenóznej trombolýzy u vhodných pacientov a trombektómie pri vhodných uzáveroch veľkých ciev. Štandardné postupy urgentnej starostlivosti pri mozgovej príhode zostávajú jedinou preukázanou cestou. Pri podozrení na mozgovú príhodu sa starostlivosť nikdy nesmie odkladať kvôli podaniu metylénovej modrej a praktické obmedzenia extrapolácie predklinického dávkovania vysvetľujú, prečo režimy u potkanov nemožno chápať ako klinické režimy.

Bezpečnostný kontext túto hranicu ešte zdôrazňuje. Intravenózna metylénová modrá má výrazné upozornenie v rámčeku na závažný alebo smrteľný sérotonínový syndróm pri kombinácii so sérotonergnými liekmi vrátane SSRI, SNRI a inhibítorov MAO, ktoré užívajú mnohí pacienti vo veku typickom pre mozgovú príhodu. Je kontraindikovaná pri deficite G6PD pre riziko hemolýzy. Inhibuje tiež signalizáciu oxidu dusnatého, čo za určitých okolností zvyšuje cievny odpor a tlak, preto ju nemožno jednoducho opisovať ako liek zvyšujúci prietok krvi mozgom. Schválený intravenózny režim 1 mg/kg pri získanej methemoglobinémii nie je režimom na liečbu mozgovej príhody.

Poctivé zhrnutie má úzky rozsah, ale opiera sa o skutočné výsledky. V období reperfúzie pri prechodnej ložiskovej ischémii nízka dávka metylénovej modrej obmedzila vývoj lézie u potkanov. Pri trvalej oklúzii vznik infarktu oddialila, ale nezabránila mu. V astrocytoch počas závažnej deprivácie škodila a pri reoxygenácii pomáhala. Počas chronickej hypoperfúzie zachovávala cytochrómoxidázu, cievy a pamäť v priebehu týždňov. Jeden prenášač, tri kontexty, tri odpovede.