Metylénová modrá a ATP: znamená vyššia spotreba kyslíka viac energie?

Izolovaná mitochondria sa nachádza v komore s palivom, ale bez ADP. Kyslík spotrebúva pomaly. Po pridaní ADP spotreba kyslíka niekoľkonásobne stúpne. Keď sa ADP vyčerpá, spotreba kyslíka opäť klesne. Palivo sa nezmenilo. Zmenil sa iba dopyt po ATP.

Táto krátka postupnosť vystihuje celý rozdiel, o ktorom je tento článok. Spotreba kyslíka meria, ako rýchlo prúdia elektróny dýchacím reťazcom ku kyslíku. Produkcia ATP meria, aká časť tohto toku sa zachytí vo forme využiteľnej energie. Oba procesy majú spoločný medzikrok: protónový gradient cez vnútornú mitochondriálnu membránu. Čokoľvek, čo zmení mieru spriahnutia tohto gradientu so syntézou ATP, môže posunúť oba výsledné ukazovatele rôznymi smermi. Metylénová modrá je v tomto smere poučným príkladom, pretože pri nej boli pozorované oba javy: v niektorých preparátoch zvýšila spotrebu kyslíka spolu s ATP, kým v iných zvýšila spotrebu kyslíka, no ATP zostalo nezmenené alebo kleslo.

Čitatelia, ktorí chcú najprv získať širší obraz o prenose elektrónov, môžu začať tým, ako metylénová modrá prenáša elektróny dýchacím reťazcom. Tí, ktorí sa chcú oboznámiť s pojmami z prvých experimentov so spotrebou kyslíka, si môžu prečítať, čo prvé merania respirácie skutočne ukázali.

Respirácia, ATP a gradient medzi nimi

Elektróny z NADH a FADH2 vstupujú do reťazca na komplexoch I a II, prechádzajú cez komplex III na cytochróm c a potom cez komplex IV ku kyslíku. Energia uvoľnená na komplexoch I, III a IV poháňa čerpanie protónov z matrix do medzimembránového priestoru. Toto oddelenie náboja a rozdiel v kyslosti vytvárajú protónmotívnu silu, ktorej elektrická zložka, membránový potenciál, zvyčajne prevláda.

ATP syntáza umožňuje protónom prúdiť späť do matrix a uvoľnenú energiu využíva na spojenie ADP a fosfátu do ATP. Postupnosť je teda takáto:

spotreba kyslíka, potom čerpanie protónov, potom gradient, potom syntéza ATP.

Háčik je v tom, že protóny sa môžu vracať aj inými cestami. Každý návrat, ktorý obchádza ATP syntázu, je únikom protónov. Únik núti reťazec znovu čerpať tie isté protóny, aby udržal stabilný membránový potenciál. Tým sa spotrebuje viac kyslíka bez toho, aby vzniklo viac ATP. Dostatočne silný únik znamená rozpojenie: spotreba kyslíka stúpa, zatiaľ čo ATP zostáva nezmenené alebo klesá a nevyužitá energia sa uvoľňuje ako teplo.

Stav 3, stav 4 a pomer respiračnej kontroly

Klasické pojmy pre tieto javy pochádzajú z výskumu izolovaných mitochondrií. Stav 3 je respirácia za prítomnosti substrátu a ADP: ATP syntáza znižuje gradient, membránový potenciál klesá, reťazec zrýchľuje, aby ho obnovil, a spotreba kyslíka je vysoká, pretože sa tvorí ATP. Stav 4 je respirácia po vyčerpaní ADP: ATP syntáza nepracuje, gradient rastie, vysoký membránový potenciál brzdí ďalšie čerpanie a spotreba kyslíka klesá na úroveň potrebnú na kompenzáciu úniku.

Pomer respiračnej kontroly, teda stav 3 delený stavom 4, preto vyjadruje mieru spriahnutia v preparáte. Vysoký pomer znamená, že ADP výrazne riadi respiráciu. Klesajúci pomer pri rastúcej respirácii v stave 4 znamená, že začína prevládať únik. Tento pohľad umožňuje pochopiť výsledky s metylénovou modrou uvedené nižšie.

Oplatí sa zapamätať si jeden jednoduchý model. Vysoký membránový potenciál spomaľuje reťazec. Rozptýlenie potenciálu ho zrýchľuje. Reťazec reaguje na to, aké náročné je čerpanie, nie priamo na to, či sa tvorí ATP.

Keď sa výsledné ukazovatele menia spoločne

Najjasnejší príklad spriahnutia pochádza z izolovaných mitochondrií z mozgu morčiat so zablokovanými komplexmi dýchacieho reťazca. Pri koncentrácii metylénovej modrej od 100 nanomolov na liter do 1 mikromolu na liter stúpla pokojová spotreba kyslíka s glutamátom a malátom, sukcinátom alebo glycerofosfátom ako palivom, zatiaľ čo respirácia stimulovaná ADP zostala nezmenená. V mitochondriách, v ktorých bol toxicky zablokovaný komplex I alebo komplex III, farbivo mierne zvýšilo produkciu ATP, obnovilo membránový potenciál a zlepšilo príjem vápnika. Navrhovanou cestou je skratka: farbivo prijíma elektróny pred miestom blokády a odovzdáva ich cytochrómu c, čím obchádza poškodený komplex.

Druhý prípad spoločného nárastu využíva úplne iný zdroj ATP. V izolovaných mozgových mitochondriách s inhibovanou ATP syntázou metylénová modrá naďalej stimulovala respiráciu pri každom testovanom substráte. Syntéza ATP však stúpla iba pri alfa-ketoglutaráte a glutamáte, dvoch substrátoch, z ktorých vzniká sukcinyl CoA. Keď oligomycín blokoval ATP syntázu, dodatočné ATP vznikalo fosforyláciou na úrovni substrátu pôsobením sukcinyl CoA ligázy v cykle kyseliny citrónovej, nie oxidačnou fosforyláciou. Farbivo tiež obnovilo membránový potenciál pri súčasnej inhibícii komplexu I a ATP syntázy. Spotreba kyslíka a ATP tu stúpali spoločne, ale iba tam, kde substrát umožňoval druhú cestu tvorby ATP. Pri sukcináte alebo maláte respirácia stúpla bez dodatočného ATP. Rovnaké farbivo, rovnaká komora, iné palivo, iný výsledok.

Keď sa výsledné ukazovatele rozchádzajú

Prípady, v ktorých sa ukazovatele rozchádzajú, sú rovnako publikované a rovnako poučné. V štúdii izolovaných mitochondrií z pečene potkanov z roku 1997 metylénová modrá zrýchlila respiráciu v stave 4 v tesne spriahnutých mitochondriách využívajúcich sukcinát, čím znížila pomer respiračnej kontroly. Účinok bol pozorovateľný od 0.5 mikromolu na liter a výrazný pri 5 mikromoloch na liter, čo je koncentrácia blízka plazmatickým hladinám po intravenóznom boluse 100 miligramov. Pri 5 mikromoloch na liter mitochondrie aj napučiavali, hoci porucha spriahnutia sa najprv objavila pri nižších koncentráciách. To naznačuje, že únik predchádzal štrukturálnemu poškodeniu, a nie že bol jeho dôsledkom. V rozpojených mitochondriách farbivo stimulovalo respiráciu spôsobom závislým od koncentrácie, pričom účinok dosahoval saturáciu. Spotreba kyslíka stúpla v oboch preparátoch. Syntéza ATP na jednotku spotrebovaného kyslíka nie. Ide o učebnicové rozpojenie spolu s prenosom elektrónov v jednej a tej istej molekule.

Najvýraznejšie oddelenie ukazovateľov pochádza zo sietnice. U myší s deficitom AIF a vo fotoreceptorových bunkách vystavených rotenónu metylénová modrá zachovala hrúbku sietnice, fotoreceptorové markery a mitochondriálnu štruktúru, znížila pomer NADH k NAD a utlmila stresové dráhy vrátane odpovede na nezložené proteíny a mitofágie. Dosiahla to bez nápravy nedostatku ATP. Ochrana bez obnovenia energie znamená, že prínos súvisel s redoxnou rovnováhou a mitochondriálnou integritou, nie s dodatočným ATP. Každý, kto by stotožnil prežitie tkaniva s obnoveným energetickým výkonom, by tento experiment interpretoval úplne nesprávne.

Výskum mozgových mitochondrií dopĺňa do tej istej bilancie aj náklady. Tie isté nízke koncentrácie, ktoré zlepšili bioenergetiku, zároveň za všetkých testovaných podmienok zvýšili tvorbu peroxidu vodíka a spomalili jeho odstraňovanie. Meralo sa to kalibrovaným testom Amplex, nie nešpecifickým farbivom. Viac ATP sprevádzalo viac oxidantu.

Praktický kontrolný zoznam pri čítaní

Štyri otázky pomáhajú odlíšiť spriahnutý výsledok od rozpojeného.

Po prvé, ktorý výsledný ukazovateľ sa skutočne meral. Samotná spotreba kyslíka nemôže vypovedať o ATP. Syntéza ATP, membránový potenciál a pomer respiračnej kontroly prinášajú každý časť informácií, ktoré kyslíková elektróda nedokáže zachytiť. Sprievodca čítaním tvrdení z výskumu metylénovej modrej podrobne vysvetľuje tento dôsledný prístup k sledovaným ukazovateľom.

Po druhé, ktorý substrát slúžil mitochondriám ako palivo. Výsledok so sukcinyl CoA ukazuje, že voľba paliva môže rozhodnúť, či sa dodatočná respirácia vôbec môže premeniť na dodatočné ATP.

Po tretie, aká koncentrácia sa použila. Metylénová modrá v nanomolárnych až nízkych mikromolárnych koncentráciách priniesla v mozgových mitochondriách mierne bioenergetické zlepšenia za cenu zvýšenej tvorby oxidantov; od pol mikromolu na liter vyššie v pečeňových mitochondriách oslabovala spriahnutie; pri 5 mikromoloch na liter sa pridalo napučiavanie. Koncentrácia je súčasťou mechanizmu, nie vedľajším detailom.

Po štvrté, v akom modeli sa výsledok dosiahol. Izolované mitochondrie odhaľujú zapojenie jednotlivých procesov, ale v neporušených bunkách a tkanivách navyše vstupujú do hry transport, redukcia na bezfarebnú formu a konkurenčné cesty odčerpávania elektrónov. Laboratórny výskum dávkovania vrátane toho, ako koncentrácia a protokol formujú účinky metylénovej modrej, tvorí most medzi číselnými údajmi z komory a akýmkoľvek tvrdením o človeku.

Spotreba kyslíka vypovedá o toku elektrónov. ATP vypovedá o tom, aká časť tohto toku sa zachytila. Metylénová modrá môže zmeniť ktorýkoľvek z týchto ukazovateľov a vyššie uvedené experimenty ukazujú všetky štyri výsledné kombinácie: oba stúpajú, respirácia stúpa s nárastom ATP iba tam, kde to substrát umožňuje, respirácia stúpa pri klesajúcom spriahnutí a tkanivo zostáva zachované, zatiaľ čo ATP sa nemení. Číslo na kyslíkovej elektróde je začiatkom interpretácie, nie jej koncom.