Metylénová modrá a Bartonella: laboratórne zistenia a limity klinických dôkazov

Kultivačnú misku a pacienta spája slovo infekcia, nie však jeho význam. V miske je infekcia počtom kolónií na agare. U pacienta ide o baktérie vo vnútri buniek a ciev, liečivá prenikajúce krvou a tkanivami a imunitný systém, ktorý vykonáva časť práce. Ak si tieto dve situácie zameníme, pôsobivé laboratórne číslo začne vyzerať ako liečba. Ak ich oddelíme, to isté číslo zostane tým, čím je: dôvodom na ďalší experiment.

Práve toto rozlíšenie je hlavným cieľom tohto prehľadu o metylénovej modrej a baktériách rodu Bartonella. Dve laboratórne štúdie jednej výskumnej skupiny skúmali metylénovú modrú proti Bartonella henselae v nerastúcich stavoch. Obe zaznamenali silnú aktivitu v sklenených a plastových nádobách. Ani jedna ju neskúšala u človeka.

Prečo výskumníci skúmajú stacionárnu fázu

Väčšina testov antibiotík používa rastúce bunky. Tento model nezachytáva náročnejší prípad: bunky, ktoré sa prestali deliť a tolerujú liečivá usmrcujúce ich rastúce náprotivky.

Bartonella môže v tele pretrvávať, a to aj vo vnútri erytrocytov a endotelových buniek. Skupina preto skúmala, ktoré schválené liečivá dokážu usmrtiť B. henselae po prechode do stacionárnej fázy. Nízka MIC proti rastúcim bunkám nepredpovedala usmrcovanie buniek v stacionárnej fáze. Rifampicín mal veľmi nízku MIC, no stacionárne bunky usmrcoval slabo, zatiaľ čo zlúčeniny s vyššími hodnotami MIC ich usmrcovali dobre. Čitatelia, ktorí hľadajú všeobecný postup na čítanie takýchto štúdií, ho nájdu v sprievodcovi čítaním výskumu metylénovej modrej.

Prvý skríning: Li a kolegovia, 2019

Skríning stacionárnej fázy z roku 2019 v časopise Antibiotics používal jediný kmeň, B. henselae JK53, pestovaný v Schneiderovom médiu s 10 percentami fetálneho bovinného séra pri 37 C a 5 percentách CO2. Jednodňové kultúry tvorili prevažne rozptýlené deliace sa bunky. Päťdňové kultúry s približne 10 na 8. jednotiek tvoriacich kolónie na mL sa považovali za kultúry v stacionárnej fáze a obsahovali viditeľné agregáty.

Použila sa metóda so SYBR Green I a propídiumjodidom, kalibrovaná pomocou zmesí živých buniek a buniek usmrtených izopropanolom. Keďže metylénová modrá je výrazne sfarbená, pozitívne výsledky sa overovali mikroskopicky a následne počítaním kolónií na krvnom agare, čo bolo prísnejšie hodnotiace kritérium.

Zo súboru 1,581 schválených liečiv pri koncentrácii 50 mikromolov na liter ponechala metylénová modrá 16 percent životaschopných buniek podľa čítačky mikrotitračných platničiek a 25 percent podľa mikroskopie. Pri daptomycíne to bolo 21 percent, pri viacerých azoloch 22 až 27 percent, pri gentamicíne 32 percent, pri erytromycíne 66 percent a pri ciprofloxacíne 74 percent. Pyrvíniumpamoát sa podľa čítačky javil ako účinnejší, no mikroskopicky sa nedal vyhodnotiť pre vlastnú fluorescenciu.

Proti rastúcim B. henselae bola MIC metylénovej modrej 0.08 až 0.16 mikrogramu na mL. Pri päťdňových stacionárnych bunkách a koncentrácii 5 mikrogramov na mL klesol počet kolónií po jednom dni expozície pod hranicu detekcie, rovnako ako pri daptomycíne a pyrvíniumpamoáte pri ich skúšaných koncentráciách. V samostatnom experimente sledujúcom časový priebeh usmrcovania sa použilo 10 mikrogramov na mL. Ide o úrovne laboratórnej expozície, nie o dávky, a článok ich tak aj uvádza. Citovaná maximálna plazmatická koncentrácia u človeka približne 3.9 mikrogramu na mL sa v článku objavuje len ako kontextová informácia. Prehľad farmakokinetiky metylénovej modrej vysvetľuje, prečo nemožno plazmatickú hodnotu považovať za hodnotu v tkanive.

Článok výslovne uvádza dve obmedzenia. Nebol použitý model biofilmu ani sa neskúšali kombinácie s metylénovou modrou. Päťdňové agregáty boli zhluky v stacionárnej tekutej kultúre, nie validovaný experiment s biofilmom. Autori vyzvali na štúdie na zvieratách, skúmanie kombinácií, výskum biofilmov a testovanie ďalších druhov rodu Bartonella.

Kombinácie a bunky získané z biofilmu: Zheng a kolegovia, 2020

Nadväzujúca štúdia z roku 2020 v časopise BMC Microbiology zachovala rovnaký kmeň a médium, ale prešla na šesťdňové stacionárne kultúry a pridala dve veci, ktoré v prvom článku chýbali: kombinácie dvoch liečiv a model buniek získaných z biofilmu.

Pri jednotlivých liečivách s jednotnou koncentráciou 5 mikrogramov na mL počas 24 hodín zostalo po expozícii metylénovej modrej 3.2 krát 10 na 4. jednotiek tvoriacich kolónie na mL, oproti približne 2.8 krát 10 na 10. v kontrolnej vzorke. Po ciprofloxacíne, gentamicíne a nitrofurantoíne zostalo v rovnakom čase menej kolónií. To sa líši od výsledku z roku 2019, keď pri rovnakej nominálnej koncentrácii neboli po jednom dni zistené žiadne kolónie. Vek kultúr, ich hustota a manipulácia s nimi sa líšili, takže usmrcovanie bolo reprodukovateľné z hľadiska smeru účinku, ale nie totožné z hľadiska rozsahu. Tento posun medzi experimentmi je jedným z dôvodov, prečo štandardné kontroly bezpečnosti a interakcií posudzujú laboratórnu účinnosť oddelene od klinického účinku.

Skríning kombinácií je najčastejšie citovanou časťou. Každá zložka mala pevnú koncentráciu 5 mikrogramov na mL. Pri azitromycíne s metylénovou modrou aj pri rifampicíne s metylénovou modrou neboli po 24 hodinách zistené žiadne kolónie zo stacionárnej fázy, rovnako ako pri oboch dvojiciach s ciprofloxacínom. Z 25 skúšaných dvojíc to platilo iba pre tieto štyri. Formálna analýza synergie sa nevykonala, takže správnym označením je aktívna kombinácia za týchto podmienok, nie preukázaná synergia.

Experiment s biofilmom skúmal bunky získané z mladého narušeného biofilmu, nie prenikanie do neporušeného zrelého biofilmu. Kultúry sa pestovali päť dní, zriedili sa do platničiek s jamkami na ďalších päť dní, prítomnosť biofilmu sa potvrdila farbením kryštálovou violeťou a pred expozíciou liečivám sa biofilm zoškrabal. Pri koncentrácii 5 mikrogramov na mL klesol po samotnej metylénovej modrej počet do dňa 6 na 2.3 krát 10 na 2., čo patrilo medzi najlepšie výsledky jednotlivých látok, ale nebolo to nula. Obe kombinácie s metylénovou modrou dosiahli do dňa 6 nulu, rovnako ako obe kombinácie s ciprofloxacínom.

Autori upozornili na rovnaké obmedzenia, aké by si všimol pozorný čitateľ: mladý zoškrabaný biofilm namiesto starého neporušeného biofilmu, jedna prakticky zvolená koncentrácia pre všetky liečivá namiesto realistickej maximálnej koncentrácie každého z nich, iba vybrané dvojice založené na azitromycíne alebo rifampicíne, jeden kmeň, žiadne zvieratá a žiadni pacienti. Neskoršie skúmanie kombinácií troch liečiv bolo navrhnuté, nie opísané ako vykonané.

Porovnanie dizajnu štúdií

Tabuľka stručne vystihuje podstatu tohto článku. Všetko naľavo od posledného stĺpca je práca s kultúrami. Ani jeden z článkov neobsahuje nič, čo by patrilo do posledného stĺpca.

Bartonella nie je Borrelia

Oba články spomínajú Borrelia burgdorferi, spirochétu spôsobujúcu lymskú boreliózu, pretože metóda s farbivami pochádzala zo skoršieho výskumu stacionárnej fázy baktérií rodu Borrelia v tom istom laboratóriu, kde metylénová modrá a daptomycín tiež vyšli ako aktívne látky. Táto história poskytuje užitočný kontext a zároveň je častým zdrojom omylov.

Žiadny experiment v oboch článkoch o baktériách rodu Bartonella netestuje súbežne Borrelia a Bartonella. Organizmy sa líšia, médiá sa líšia, koncentrácie sa líšia a predpokladaný účinok metylénovej modrej na membránu baktérií rodu Bartonella bol uvedený ako špekulácia vyžadujúca ďalšie skúmanie. Výsledky sa nemajú prenášať medzi druhmi a ani jeden článok nepodporuje všeobecné tvrdenia o parazitoch. Porovnanie perzistentných buniek rodov Borrelia a Bartonella z tohto dôvodu posudzuje príslušné výskumné poznatky oddelene.

Prečo sa výsledky kultivácií nedajú premeniť na protokol

Záujem o vyhľadávanie protokolu s metylénovou modrou proti baktériám rodu Bartonella je pochopiteľný. Tieto články ukazujú, prečo treba takúto frázu považovať skôr za varovný signál než za nákupný zoznam.

Po prvé, 5 mikrogramov na mL v jamke nie je lekársky predpis. Tento údaj nezahŕňa vstrebávanie, distribúciu, väzbu na bielkoviny, prenikanie do buniek ani znášanlivosť. Autori ho zvolili ako približný priemer maximálnych koncentrácií antibiotík a uviedli, že budúci výskum by mal používať každé liečivo v jeho vlastnej realistickej koncentrácii.

Po druhé, nula kolónií znamená žiadne kolónie za daných podmienok kultivácie na platniach, nie sterilné tkanivo. Perzistentné bunky, vnútrobunkové baktérie a obmedzenia odberu vzoriek zostávajú mimo agarovej platne.

Po tretie, kombinácie, ktoré sterilizujú obsah jamky, môžu v tele zlyhať alebo uškodiť. Azitromycín s metylénovou modrou a rifampicín s metylénovou modrou sú laboratórne dvojice pri laboratórnych expozíciách. Bez farmakokinetických údajov zo zvierat a kontrolovaných údajov od ľudí nie je stanovená dávka, trvanie ani pomer prínosu a rizika. Každý, kto zvažuje možnosti, by ich mal prediskutovať s lekárom a oboznámiť sa s tým, kedy si používanie metylénovej modrej vyžaduje lekársky dohľad, skôr než z údajov z kultivačných misiek vyvodí akýkoľvek záver.

Úzky záver, ktorý tieto články skutočne podporujú, znie takto: metylénová modrá má reprodukovateľnú aktivitu proti nerastúcim B. henselae JK53 in vitro, a to aj v laboratórnych kombináciách dvoch liečiv, pričom najsilnejšie výsledky kombinácií a experimentov s bunkami získanými z biofilmu pochádzajú zo štúdie z roku 2020. Všetko ostatné vrátane toho, či je táto aktivita významná pri bartonelóze u ľudí, zostáva neoverené.