EMB agar verzus MacConkey agar: výber a interpretácia médií

Študent naočkuje tú istú vzorku vody vyčerpávacím očkovaním na dve misky. Na jednej sa objavia tmavé kolónie so zeleným kovovým leskom. Na druhej sa objavia jasne ružové kolónie s hmlistým halom. Obe misky boli naočkované z tej istej skúmavky, inkubované vedľa seba a odčítané v rovnakom čase. Študent sa pýta, ktorá miska je správna.

Správne sú obe. Odpovedajú na odlišné otázky. Zmätok vzniká vtedy, keď sa tieto dve médiá považujú za vzájomne zameniteľné skríningové médiá pre črevné baktérie. Majú spoločný účel: selektovať Gram negatívne enterické organizmy a odlíšiť fermentujúce laktózu od nefermentujúcich, ale tento účel realizujú odlišnou chémiou a odlišnou vizuálnou logikou. Keď pochopíte tieto dva základné princípy, výber misky a odčítanie kolónií sa stanú rutinnými.

Stručná odpoveď

EMB agar používa dve farbivá, eozín Y a metylénovú modrú, ktoré plnia dve úlohy súčasne: potláčajú rast Gram pozitívnych baktérií a zrážajú sa okolo silných producentov kyselín, čím vytvárajú tmavé kolónie, pri Escherichia coli klasicky s kovovým zeleným leskom. MacConkey agar tieto úlohy oddeľuje: žlčové soli spolu s kryštálovou violeťou potláčajú Gram pozitívne baktérie, laktóza slúži ako substrát pre fermentáciu a neutrálna červeň signalizuje vznik kyseliny ružovým alebo červeným sfarbením kolónií. Ak je cieľom výrazná predbežná demonštrácia E. coli, EMB má svoje opodstatnenie. Ak je cieľom jasné rozdelenie fermentujúcich laktózu od nefermentujúcich na ružové verzus bezfarebné kolónie, najmä pri pracovných postupoch so stolicou alebo močom, MacConkey sa zvyčajne odčítava jednoduchšie. Ani jedno médium neurčuje organizmus iba podľa farby.

EMB: farbivá, ktoré súčasne selektujú aj indikujú

Princíp EMB spája selekciu a indikáciu do tých istých molekúl. Protokol ASM pre eosin methylene blue agar opisuje EMB ako selektívne aj diferenciálne médium, pričom dvojica farbív inhibuje mnohé Gram pozitívne organizmy a fermentácia laktózy podporuje príjem a zrážanie farbív. Štandardná Levineova formulácia obsahuje peptón, laktózu, fosfát, eozín Y, metylénovú modrú a agar, ako uvádza metóda FDA BAM pre Levine EMB agar. Všimnite si, že staršie receptúry EMB niekedy pridávali popri laktóze aj sacharózu, zatiaľ čo Levine EMB obsahuje laktózu bez sacharózy, preto si zaznamenajte, ktorú formuláciu používa vaše laboratórium.

Odčítanie EMB znamená sledovanie správania farbív. Intenzívna fermentácia laktózy vytvára dostatok kyseliny na výrazné vyzrážanie farbív, čím E. coli získava tmavomodré až čierne stredy a v klasickom prípade zelený kovový lesk v odrazenom svetle. Slabšie fermentujúce organizmy, ako Enterobacter a Klebsiella, zvyčajne rastú ako ružové až fialové mukoidné kolónie bez tohto lesku. Nefermentujúce organizmy, ako Salmonella, Shigella a Proteus, zvyčajne rastú ako bezfarebné alebo priesvitné kolónie, pretože nevytvárajú prudký nárast kyslosti potrebný na vyzrážanie farbív. Gram pozitívne baktérie sú zvyčajne potlačené, hoci miera potlačenia sa líši podľa kmeňa a produktu. Podrobná chémia prípravy farbív vrátane vysvetlenia, prečo sa metylénová modrá správa ako katiónové farbivo, patrí do samostatnej diskusie o formuláciách farbív a všeobecný mikroskopický kontext nájdete v atlase metód farbenia. Tento článok sa sústreďuje na výber misiek a ich odčítanie.

Obrázok vyššie je ilustračný. Znázorňuje očakávanú vizuálnu logiku: na EMB tmavé kolónie s leskom, ružové mukoidné typy a bledé typy, oproti ružovým verzus bledým typom na MacConkey. Použite ho na osvojenie vzoru a potom každý záver overte podľa fotografovaných kontrol a príbalovej dokumentácie presného média používaného na vašom pracovisku.

MacConkey: oddelené úlohy, jednoduchšie vizuálne pravidlo

Princíp MacConkey priraďuje každú úlohu samostatnej zložke. Protokol ASM pre MacConkey agar používa rovnaké označenie selektívneho a diferenciálneho média a metóda FDA BAM pre MacConkey agar uvádza funkčné zložky: peptóny, laktózu, žlčové soli, soľ, neutrálnu červeň, kryštálovú violeť a agar. Žlčové soli spolu s kryštálovou violeťou selektujú proti Gram pozitívnym baktériám. Laktóza poskytuje substrát pre fermentáciu. Neutrálna červeň funguje ako indikátor pH a v miestach tvorby kyseliny sa mení na ružovú až červenú, pričom okolo silne fermentujúcich kolónií sa niekedy vyzrážajú žlčové soli.

Pravidlo odčítania je zámerne jednoduché: ružová znamená fermentáciu laktózy, bezfarebná alebo bledá znamená nefermentujúci organizmus. E. coli je ružová až červená, často s halom vyzrážaných žlčových solí. Klebsiella a Enterobacter sú ružové a často mukoidné vďaka svojim kapsulám. Salmonella, Shigella, Proteus a mnohé ďalšie Gram negatívne tyčinky sú bezfarebné. V učebných laboratóriách je užitočná aj ďalšia vlastnosť: žlčové soli vo všeobecnosti obmedzujú plazivý rast Proteus, takže na MacConkey je jednoduchšie získať izolované kolónie než na neselektívnych médiách, hoci potlačenie nie je absolútne a tam, kde je prioritou kontrola plazivého rastu, existujú alternatívy bez soli.

Molekulárny dôvod takéhoto správania farbív súvisí s nábojom a štruktúrou. Metylénová modrá je katiónové fenotiazínové farbivo, ktorého štruktúra a vlastnosti vysvetľujú jeho afinitu ku kyslým bakteriálnym povrchom; rovnaká afinita sa uplatňuje aj pri jeho zrážaní v kyslých zónach na EMB.

Porovnanie na prvý pohľad

Tabuľku čítajte ako rozhodovací postup. Keď má cvičenie ukázať študentom gradient intenzity fermentácie s jedným výrazným koncovým prejavom, vhodné je EMB. Keď cvičenie vyžaduje rýchle binárne rozdelenie pred biochemickým potvrdením, vhodný je MacConkey.

Ktoré médium pre ktorú vzorku

Pri cvičeniach s vodou zameraných na predbežné rozpoznanie fekálnych koliformných baktérií alebo E. coli je EMB atraktívny, pretože jeho lesk je vizuálne výrazný. MacConkey tiež umožňuje prácu s enterickými Gram negatívnymi baktériami a historicky sa používal pri analýze vody, ale ani jedna z týchto misiek nenahrádza regulačnú metódu analýzy vody, ktorá môže podľa konkrétneho testu určovať médiá ako modified mTEC alebo MI. Overte si metódu, ktorú musí vaše laboratórium dodržiavať.

Pri separáciách typu vyšetrenia stolice, kde sa oddeľujú fermentujúce organizmy od nefermentujúcich, je z týchto dvoch médií vo všeobecnosti užitočnejší MacConkey. Praktická práca so stolicou zameraná na Salmonella alebo Shigella zvyčajne pridáva selektívnejšie enterické médiá, ako XLD alebo Hektoen enteric, namiesto spoliehania sa iba na MacConkey.

Pri výučbe s močom, ktorá napodobňuje klinický pracovný postup, kombinujte MacConkey s krvným agarom. MacConkey poskytuje počiatočné rozdelenie Gram negatívnych baktérií, zatiaľ čo krvný agar umožňuje rast organizmov, ktoré MacConkey potláča. Táto kombinácia je štandardne uvádzaná v klinických opisoch kultivácie moču.

Pri výučbe samotného princípu použite obe médiá. EMB ukazuje, že intenzita fermentácie je dôležitá a že jedna molekula môže plniť dve úlohy. MacConkey učí modulárny dizajn: selektor, substrát a indikátor sú oddelené. Študenti, ktorí vedľa seba naočkujú známy E. coli, známy Klebsiella aerogenes a známu Salmonella na obe médiá, si tieto dve logiky už zriedka zamieňajú.

Úskalia pri odčítaní, ktoré sa opakujú každý semester

Najčastejšou chybou je identifikácia iba podľa farby. Ružová kolónia na MacConkey môže byť E. coli, Klebsiella, Enterobacter alebo iný fermentujúci organizmus. Bezfarebná môže byť Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas alebo iný nefermentujúci organizmus. Farba je skríningový fenotyp, ktorý usmerňuje následné potvrdzovacie vyšetrenia, ako Gramovo farbenie, oxidázový test, biochemické panely alebo prístrojová identifikácia; nie je to názov druhu.

Druhou chybou je preceňovanie neprítomnosti lesku. Niektoré skutočné kolónie E. coli, najmä izolované, vytvárajú na EMB len malý alebo žiadny kovový lesk. Neprítomnosť lesku nevylučuje E. coli a jeho prítomnosť ju nedokazuje. Lesk považujte za predbežnú indíciu.

Treťou chybou je porovnávanie misiek rôzneho veku. Oneskorene fermentujúce laktózu môžu po predĺženej inkubácii na MacConkey zružovieť, čím sa narúša jasné rozdelenie na fermentujúce verzus nefermentujúce. Odčítajte v hodine určenej laboratóriom a spolu s výsledkom zaznamenajte čas inkubácie.

Štvrtou chybou je interpretovať zmiešaný rast ako jeden organizmus. Ružová kolónia vedľa bezfarebnej kolónie predstavuje dva fenotypy, nie prechodný stav. Vyberajte dobre izolované kolónie a každý morfotyp spracujte samostatne. Mukoidná textúra vytvára podobnú pascu: Klebsiella aj Enterobacter môžu vyzerať mukoidne, takže samotná kapsula nikdy neurčí názov. Organizmus, ktorý sa kedysi vyučoval ako Enterobacter aerogenes, je dnes klasifikovaný ako Klebsiella aerogenes, čo vysvetľuje, prečo sa staršie tabuľky a novšie označenia zdanlivo nezhodujú.

Kontroly a záverečné pravidlo

Pri každom pracovnom bloku používajte fotografované alebo čerstvé kontroly: E. coli pre reakciu silného fermentujúceho organizmu, Klebsiella aerogenes pre mukoidnú fermentáciu bez klasického lesku, kmeň Salmonella pre bezfarebnú reakciu nefermentujúceho organizmu a Staphylococcus aureus na potvrdenie potlačenia Gram pozitívnych baktérií pri vašom konkrétnom produkte. Čísla kmeňov a akceptačné kritériá prispôsobte dokumentácii výrobcu, pretože selektivita sa mení podľa obsahu žlče, kryštálovej violete a farbív.

Pri práci pri stole si zapamätajte jednu vetu. EMB používa farbivá, ktoré zároveň selektujú aj signalizujú, čím poskytuje výrazný signál E. coli za cenu jemnejšieho odčítania. MacConkey oddeľuje selekciu od signalizácie, čím poskytuje jednoduché rozdelenie na ružové verzus bledé kolónie za cenu menšieho množstva informácií o intenzite fermentácie. Vyberte médium, ktorého princíp zodpovedá otázke, potvrďte farbu vhodnými testami a tieto dve misky prestanú súperiť a začnú sa dopĺňať.