ලිපිය
අණ්වීක්ෂණය සඳහා මෙතිලීන් බ්ලූ වෙනුවට විකල්ප: කාර්යය අනුව තෝරන්න
සරල බැක්ටීරියා ස්මියරයක් සඳහා, අරමුණ සෛල හැඩය දැකීම නම් මෙතිලීන් බ්ලූ වෙනුවට ක්රිස්ටල් වයලට් භාවිත කළ හැක. ජීවමාන සෛල සඳහා, වඩා සුදුසු විකල්පය කිසිදු වර්ණකයක් නොමැති phase contrast විය හැක. තේරීම රඳා පවතින්නේ ඔබට කළ යුතු නිරීක්ෂණය මතය.
එකම බැක්ටීරියා සංස්කෘතිය පුද්ගලයන් දෙදෙනෙකු පරීක්ෂා කරන බව සිතන්න. එක් අයෙකුට දණ්ඩාකාර සෛල වටකුරු සෛලවලින් වෙන්කර හඳුනාගැනීමට අවශ්යය. අනෙක් අයෙකුට ප්රතිකාරයක් බැක්ටීරියා මරා දමා තිබේද යන්න දැනගැනීමට අවශ්යය. පළමු පුද්ගලයාට පැහැදිලි රූපයක් ලබාදෙන වර්ණකයක් දෙවන පුද්ගලයාට භාවිත කළ හැකි පිළිතුරක් නොදිය හැක.
විකල්පයක් තෝරාගැනීමට පෙර මෙම වාක්යය සම්පූර්ණ කරන්න: “මට ___ තුළ ___ නිරීක්ෂණය කළ යුතු අතර, සෛල ජීවමානව පැවතිය යුතුය / අවශ්ය නැත.” එම වාක්යය වර්ණකය ඉටු කළ යුතු කාර්යය නිර්වචනය කරයි.
නියැදිය සහ ප්රශ්නයෙන් ආරම්භ කරන්න
පළමුව සෛල ජීවමානව පැවතිය යුතුද යන්න තීරණය කර, ඉන්පසු ඔබට නිරීක්ෂණය කිරීමට අවශ්ය ලක්ෂණය හඳුනාගන්න:
- සෛල ජීවමානව පැවතිය යුතුය: චලනය හෝ හැඩය සඳහා, වර්ණ නොගැන්වූ phase contrast හෝ DIC සලකා බලන්න; න්යෂ්ටික DNA සඳහා, ප්රතිදීප්ත රූපකරණය සමඟ Hoechst 33342 සලකා බලන්න; පටල අඛණ්ඩතාව සඳහා, SYTO 9 සහ propidium iodide වැනි වලංගු කර ඇති පරීක්ෂණයක් තෝරන්න.
- සෛල ජීවමානව පැවතිය යුතු නැත: බැක්ටීරියා රූපවිද්යාව සඳහා, ක්රිස්ටල්-වයලට් සරල වර්ණගැන්වීමක් හෝ නිග්රොසින් negative stain එකක් සලකා බලන්න; Gram ප්රතික්රියාව සඳහා, සම්පූර්ණ Gram-stain ක්රමය භාවිත කරන්න; ස්ථිර කළ සෛලවල න්යෂ්ටික DNA සඳහා, DAPI ප්රතිදීප්ත රූපකරණය සලකා බලන්න. එක් එක් ශාඛාවේ සීමාවන් සංසන්දනය කිරීමට මෙම වගුව භාවිත කරන්න. මේවා ක්රම තෝරාගැනීම් වන අතර, දැනට පවතින ප්රොටෝකෝලයක් තුළ බෝතල් මාරු කිරීම සඳහා උපදෙස් නොවේ.
| ඔබට නිරීක්ෂණය කිරීමට අවශ්ය දේ | නියැදිය සහ උපකරණ | විකල්ප අපේක්ෂකයා | ප්රධාන සීමාව |
|---|---|---|---|
| බැක්ටීරියා හැඩය සහ සැකැස්ම | සකස් කළ බැක්ටීරියා ස්මියරය; brightfield | ක්රිස්ටල් වයලට් සරල වර්ණගැන්වීම | රූපවිද්යාව පෙන්වයි; Gram ප්රතික්රියාව හෝ ජීවත්වීම තහවුරු නොකරයි. |
| අඳුරු පසුබිමකට එරෙහි සෛල පිටරේඛා | බැක්ටීරියා විද්යාත්මක සකස් කිරීම; brightfield | නිග්රොසින් negative stain | සකස් කිරීම සහ සංයුතිය වැදගත්ය; වර්ණ නොගැන්වූ සෛලයක් අනිවාර්යයෙන්ම ජීවමාන නොවේ. |
| Gram ප්රතික්රියාව | සකස් කළ බැක්ටීරියා ස්මියරය; brightfield | සම්පූර්ණ Gram-stain ක්රමය | සම්පූර්ණ ප්රතික්රියාකාරක අනුක්රමය සහ පාලන අවශ්ය වේ. |
| ජීවමාන සෛලවල චලනය හෝ වෙනස්කම් | ගැළපෙන තෙත් සකස් කිරීම; phase contrast හෝ DIC | වර්ණකයක් නැත | සුදුසු දෘශ්ය පද්ධතියක් අවශ්යය; contrast මගින් අණුවක් හඳුනා නොගනී. |
| න්යෂ්ටික DNA | ස්ථිර කළ සෛල; ප්රතිදීප්ත රූපකරණය | DAPI | ගැළපෙන excitation සහ emission පෙරහන් අවශ්ය වේ. |
| ජීවමාන සෛලවල න්යෂ්ටික DNA | ජීවමාන සෛල; ප්රතිදීප්ත රූපකරණය | Hoechst 33342 | සෛලයට ඇතුළුවීමෙන් රූපකරණ තත්ත්වයන් හානිකර නොවන බව තහවුරු නොවේ. |
| බැක්ටීරියා පටල අඛණ්ඩතාව | ස්ථිර නොකළ බැක්ටීරියා; ප්රතිදීප්ත රූපකරණය | propidium iodide සමඟ SYTO 9 | පටල වර්ණගැන්වීම ජීවත්වීමේ වක්ර මිනුමකි. |
සරල ස්මියරයක් සඳහා, ක්රමය ප්රවේශමෙන් ප්රතිස්ථාපනය කරන්න
කාර්යය බැක්ටීරියා රූපවිද්යාව එකම වර්ණයකින් බැලීම නම් ක්රිස්ටල් වයලට් ප්රායෝගික අපේක්ෂකයකි. FDA හි Bacteriological Analytical Manual හි සරල වර්ණගැන්වීම සඳහා සුදුසු ක්රිස්ටල්-වයලට් සංයුති දෙකක් දක්වා ඇත. ලේඛනගත සංයුතියක් සහ එහි සකස් කිරීමේ ක්රමය භාවිත කරන්න; වර්ණකයේ නම පමණක් ක්රියාකාරී ප්රතික්රියාකාරකයක් නිර්වචනය නොකරයි.
ක්රිස්ටල් වයලට් Gram වර්ණගැන්වීමේදීද භාවිත වේ, නමුත් ඒ නිසා ක්රිස්ටල්-වයලට් සරල වර්ණගැන්වීමක් Gram stain එකක් බවට පත් නොවේ. ASM Gram-stain ප්රොටෝකෝලයේ, වෙනස්කම් පෙන්වන ප්රතිඵලය රඳා පවතින්නේ ක්රිස්ටල් වයලට්, අයඩින්, decolorization සහ counterstaining අනුක්රමයෙන් ක්රියා කිරීම මතය. එම පියවර ඉවත් කිරීමෙන් රූපයෙන් තහවුරු කළ හැකි දේ වෙනස් වේ. එම වෙනස සඳහා සරල වර්ණගැන්වීම සහ Gram වර්ණගැන්වීම අතර වෙනස බලන්න.
නිග්රොසින් පිටරේඛා පෙන්වීමට වෙනස් ක්රමයක් සපයයි: එය පසුබිම අඳුරු කරන අතර බැක්ටීරියා සෛල සාපේක්ෂව පැහැදිලිව පවතී. සාමාන්ය විකල්ප ලැයිස්තුවකින් මඟහැරිය හැකි වැදගත් විස්තරයක් Merck හි නිග්රොසින් උපදෙස්වල ඇත. එහි නියමිත ක්රියාකාරී සංයුතියට formaldehyde ඇතුළත් වේ. එබැවින් සෛලම වර්ණ නොගැන්වූවද, “negative stain” යන වචන මත පමණක් පදනම් වී එය ජීවමාන සෛල සමඟ ගැළපෙන බව නිගමනය කළ නොහැක. සම්පූර්ණ සංයුතිය සහ නියැදි සකස් කිරීම පරීක්ෂා කරන්න.
ජීවමාන නියැදි සඳහා, දෘශ්ය පද්ධතිය වෙනස් කිරීම සලකා බලන්න
සෛල චලනය වන ආකාරය හෝ බෙදෙන ආකාරය නිරීක්ෂණය කිරීමට ඔබට අවශ්ය නම්, තවත් වර්ණකයක් එක් කිරීම නිරීක්ෂණය සංකීර්ණ කළ හැක. Nikon විසින් පාරදෘශ්ය නියැදිවල contrast පිළිබඳ මාර්ගෝපදේශයේ පැහැදිලි කරන පරිදි, phase contrast සහ differential interference contrast, හෙවත් DIC, නියැදිවල දෘශ්ය ගුණවල වෙනස්කම් භාවිතයෙන් ඒවා දෘශ්යමාන කරයි. අණ්වීක්ෂයට අවශ්ය සංරචක තිබේ නම්, ඒවාට ජීවමාන, වර්ණ නොගැන්වූ සෛල පෙන්විය හැක.
මෙම තේරීම වර්ණ නොගැන්වූ සකස් කිරීමක් පවත්වාගනී, නමුත් ලැබෙන තොරතුරු වෙනස් කරයි. contrast එක නිපදවූ අණුව කුමක්දැයි නොදැන සීමාවක් හෝ චලනයක් අනුගමනය කළ හැක. ප්රශ්නය අණුක ස්ථානගත කිරීම නම්, ඒ වෙනුවට සුදුසු labeling ක්රමයක් තෝරන්න.
න්යෂ්ටික DNA සඳහා, Invitrogen හි DAPI සහ Hoechst වර්ණක සංසන්දනය ස්ථිර කළ සෛල සමඟ DAPI බහුලව භාවිත කිරීම සහ ජීවමාන සෛල labeling සඳහා වඩාත් කැමති, සෛලයට වැඩි වශයෙන් ප්රවේශ විය හැකි Hoechst 33342 අතර වෙනස දක්වයි. දෙකටම ප්රතිදීප්ත උපකරණ අවශ්ය වේ. එකක්වත් වර්ණවත් brightfield වර්ණකයක සෘජු ප්රතිස්ථාපනයක් නොවේ.
වර්ණකයට නිරාවරණය වීම සහ ආලෝකනය පර්යේෂණාත්මක තත්ත්වයන් ලෙස සලකන්න. ඔබ මනින දේ සෛලවල හැසිරීම නම්, වර්ණගැන්වූ සහ වර්ණ නොගැන්වූ සකස් කිරීම් සංසන්දනය කරන්න.
රතු සෛලයක් ස්වයංක්රීයව මියගිය සෛලයක් නොවේ
බැක්ටීරියා පටල අඛණ්ඩතාව තක්සේරු කිරීම සඳහා SYTO 9 සහ propidium iodide බොහෝවිට යුගලයක් ලෙස භාවිත වේ. BacLight අත්පොත අඛණ්ඩ පටල හරිත වර්ණගැන්වීම සමඟත් හානියට පත් පටල රතු වර්ණගැන්වීම සමඟත් සම්බන්ධ කරයි. එම අර්ථකථනය නියැදිය සඳහා වලංගු කරගත යුතුය.
Rosenberg සහ සගයන් විසින් 2019 දී සිදු කළ අධ්යයනයක් මෙම ගැටලුව පැහැදිලි කරයි. phosphate-buffered saline තුළ වීදුරු මත පැවති පැය 24ක E. coli biofilms වලදී, සෛලවලින් 96%ක් පමණ in situ ලෙස propidium-iodide-positive බව පෙනුණි. එහෙත් කතුවරුන් ඇස්තමේන්තු කළේ එකතු කිරීමෙන් පසු 82%ක් වගා කළ හැකි බවයි. Confocal රූපවල රතු වර්ණගැන්වූ ද්රව්යයට යටින් හරිත අභ්යන්තර සහිත සෛල පෙන්වූ අතර, නොමඟ යවන සංඥාවට බාහිර සෛලීය nucleic acids සම්බන්ධ බව පෙන්වා දුන්නේය.
එම ප්රතිශත අධ්යයනයේ සකස් කිරීම් මත කළ වෙනස් මිනුම් විස්තර කරන අතර, ඒවා සර්වවිශ්වීය නිවැරදි කිරීමේ ගුණකයක් නොවේ. ප්රයෝජනවත් පාඩම වන්නේ සංඥාව උත්පාදනය කළේ කුමක්ද යන්න පරීක්ෂා කිරීමයි. biofilm එකකදී, nucleic-acid වර්ණකයකට හානියට පත් සෛල ඇතුළත ද්රව්ය පමණක් නොව සෛලවලින් පිටත ද්රව්යද හඳුනාගත හැක. ජීවත්වීම පිළිබඳ නිගමනයක් සඳහා, එක් එක් ක්රමයට සීමාවන් ඇති බව පිළිගනිමින්, වගා කිරීම හෝ පරිවෘත්තීය ක්රියාකාරිත්වය වැනි අනුපූරක මිනුම් භාවිත කිරීමට පර්යේෂකයන් නිර්දේශ කරයි.
විකල්පයේ ඇත්ත වශයෙන්ම අඩංගු දේ පරීක්ෂා කරන්න
විකල්ප වර්ණගැන්වීමේ ක්රමයක තවමත් මෙතිලීන් බ්ලූ අඩංගු විය හැක. Giemsa එයට උදාහරණයකි: Merck තම නිෂ්පාදනය azure-eosin-methylene-blue ද්රාවණයක් ලෙස විස්තර කරයි, රුධිර සහ ඇටමිදුළු ස්මියර ඇතුළු භාවිත සඳහා නිර්මාණය කර ඇත. එය වෙනත් නියැදියක් සඳහා වෙනත් ක්රමයක් විය හැකි නමුත්, මෙතිලීන් බ්ලූ ඉවත් කළ යුතුය යන අවශ්යතාවයක් එය සපුරාලන්නේ නැත.
සංයෝගයක් ඉවත් කිරීම පර්යේෂණයේ කොටසක් නම්, රූප සංසන්දනය කිරීමට පෙර ප්රතික්රියාකාරකයේ අනන්යතාව සහ සංයුතිය පරීක්ෂා කරන්න. methyl blue, methylene blue සහ සමාන නම් ඇති වර්ණක පිළිබඳ මාර්ගෝපදේශය නාමකරණ වෙනස්කම් පැහැදිලි කරයි.
ප්රතිඵලය භාවිත කිරීමට පෙර ප්රතිස්ථාපනය සත්යාපනය කරන්න
නව ක්රමයක් සඳහා, නියෝජිත නියැදි සහ සුදුසු පාලනයක් භාවිත කර කුඩා සංසන්දනයක් කරන්න. හැකි තරම් අණ්වීක්ෂ සැකසුම් සංසන්දනය කළ හැකි ලෙස තබාගන්න. වඩා හොඳ පෙනුමක් ඇති රූපයක් හුදෙක් කැමති එකක් ලෙස තෝරාගැනීම වෙනුවට විමර්ශනය කළ හැකි වන පරිදි ප්රතික්රියාකාරක සංයුතිය, නියැදි සකස් කිරීම, නිරාවරණය සහ රූපකරණ තත්ත්වයන් සටහන් කරන්න.
සාර්ථකත්වය මුල් ප්රශ්නයට සාපේක්ෂව තක්සේරු කරන්න. රූපවිද්යාව සඳහා, සෛල සීමා සහ සැකැස්ම තවමත් අර්ථකථනය කළ හැකිදැයි තක්සේරු කරන්න. න්යෂ්ටික labeling සඳහා, සංඥාවේ ස්ථානය සහ පසුබිම තක්සේරු කරන්න. ජීවත්වීම සඳහා, ආකර්ෂණීය වර්ණ වෙන්වීමකට වඩා වැඩි සාක්ෂි අවශ්ය කරන්න. මෙතිලීන් බ්ලූ වර්ණගැන්වීම සහ රසායනාගාර භාවිත පිළිබඳ පුළුල් මාර්ගෝපදේශය නිරීක්ෂණය සහ සකස් කිරීම එකිනෙකට සම්බන්ධ වන ආකාරය පැහැදිලි කරයි.
ඔබට අවශ්ය මිනුම පවත්වාගන්නා විකල්පය තෝරන්න. වර්ණය යනු ලැබෙන රූපයේ එක් ගුණාංගයක් පමණි.