مائڪروسڪوپي لاءِ ميٿيلين بليو جا متبادل: ڪم موجب چونڊيو

هڪ سادي بيڪٽيريل سميئر لاءِ، جڏهن مقصد سيلن جي شڪل ڏسڻ هجي ته ڪرسٽل وائلٽ ميٿيلين بليو جي جاءِ وٺي سگهي ٿو. زنده سيلن لاءِ، وڌيڪ مناسب متبادل شايد بنا ڪنهن رنگ جي فيز ڪنٽراسٽ هجي. چونڊ ان مشاهدي تي دارومدار رکي ٿي جيڪو توهان کي ڪرڻو آهي.

فرض ڪريو ته ٻه ماڻهو ساڳئي بيڪٽيريل ڪلچر جو جائزو وٺي رهيا آهن. هڪ ماڻهو راڊ جهڙن سيلن کي گول سيلن کان ڌار سڃاڻڻ چاهي ٿو. ٻيو ڄاڻڻ چاهي ٿو ته ڇا ڪنهن علاج بيڪٽيريا کي ماري ڇڏيو آهي. جيڪو رنگ پهرين ماڻهو کي صاف تصوير ڏئي ٿو، اهو ٻئي ماڻهو کي شايد ڪو ڪارائتو جواب نه ڏئي.

متبادل چونڊڻ کان اڳ، هي جملو مڪمل ڪريو: “مون کي ___ ۾ ___ جو مشاهدو ڪرڻو آهي، ۽ سيلن جو زنده رهڻ ضروري آهي / ضروري ناهي.” هي جملو اهو ڪم واضح ڪري ٿو جيڪو رنگ کي ڪرڻو آهي.

نموني ۽ سوال سان شروع ڪريو

پهريان طئي ڪريو ته ڇا سيلن جو زنده رهڻ ضروري آهي، پوءِ اها خاصيت سڃاڻو جنهن جو توهان کي مشاهدو ڪرڻو آهي:

• سيلن جو زنده رهڻ ضروري آهي: حرڪت يا شڪل لاءِ، بنا رنگ جي فيز ڪنٽراسٽ يا DIC تي غور ڪريو؛ نيوڪليئر DNA لاءِ، فلوريسنس سان Hoechst 33342 تي غور ڪريو؛ ميمبرين جي سالميت لاءِ، تصديق ٿيل ايسي چونڊيو، جهڙوڪ SYTO 9 سان propidium iodide.
• سيلن جو زنده رهڻ ضروري ناهي: بيڪٽيريل مورفولوجي لاءِ، ڪرسٽل وائلٽ سادو رنگ يا نائگروسن نيگيٽو رنگ تي غور ڪريو؛ Gram ردعمل لاءِ، مڪمل Gram-stain طريقو استعمال ڪريو؛ فڪس ٿيل سيلن ۾ نيوڪليئر DNA لاءِ، DAPI فلوريسنس تي غور ڪريو.

هر شاخ جون حدون ڀيٽڻ لاءِ هي جدول استعمال ڪريو. اهي طريقي جون چونڊون آهن، ڪنهن موجوده پروٽوڪول ۾ بوتلون مٽائڻ جون هدايتون ناهن.

سادي سميئر لاءِ، طريقو احتياط سان مٽايو

جڏهن ڪم بيڪٽيريل مورفولوجي کي هڪ رنگ ۾ ڏسڻ هجي ته ڪرسٽل وائلٽ هڪ عملي اميدوار آهي. FDA جو Bacteriological Analytical Manual سادو رنگ ڏيڻ لاءِ مناسب ڪرسٽل وائلٽ جون ٻه فارموليشنون درج ڪري ٿو. دستاويز ٿيل فارموليشن ۽ ان جي تياري جو طريقو استعمال ڪريو؛ رڳو رنگ جو نالو ڪم ڪندڙ ريجنٽ جي مڪمل وضاحت نٿو ڪري.

ڪرسٽل وائلٽ Gram staining ۾ به استعمال ٿئي ٿو، پر ان سان ڪرسٽل وائلٽ جو سادو رنگ Gram stain نٿو بڻجي. ASM Gram-stain پروٽوڪول ۾، تفريقي نتيجو ڪرسٽل وائلٽ، آئيڊين، decolorization، ۽ counterstaining جي ترتيبوار عمل تي دارومدار رکي ٿو. انهن مرحلن کي ڇڏڻ سان تصوير مان ثابت ڪري سگهجندڙ معلومات بدلجي وڃي ٿي. هن فرق لاءِ سادو staining بمقابله Gram staining ڏسو.

نائگروسن حدون نمايان ڪرڻ جو مختلف طريقو ڏئي ٿو: اهو پسمنظر کي اونداهو ڪري ٿو جڏهن ته بيڪٽيريل سيل نسبتاً هلڪا رهن ٿا. Merck جي نائگروسن هدايتن ۾ هڪ اهم تفصيل آهي جيڪو متبادلن جي عام فهرست مان رهجي سگهي ٿو. ان جي بيان ڪيل ڪم ڪندڙ فارموليشن ۾ formaldehyde شامل آهي. تنهنڪري رڳو “negative stain” جي لفظن مان زنده سيلن سان مطابقت جو نتيجو نٿو ڪڍي سگهجي، جيتوڻيڪ سيل پاڻ بنا رنگ جا نظر اچن. مڪمل فارموليشن ۽ نموني جي تياري چيڪ ڪريو.

زنده نمونن لاءِ، آپٽڪس بدلائڻ تي غور ڪريو

جيڪڏهن توهان سيلن کي حرڪت يا ورهاست ڪندي ڏسڻ چاهيو ٿا، ته ٻيو رنگ شامل ڪرڻ مشاهدي کي پيچيده ڪري سگهي ٿو. Nikon پنهنجي شفاف نمونن ۾ ڪنٽراسٽ بابت گائيڊ ۾ بيان ڪري ٿو ته فيز ڪنٽراسٽ ۽ differential interference contrast، يا DIC، نمونن کي انهن جي آپٽيڪل خاصيتن ۾ فرق ذريعي ڏسڻ لائق بڻائين ٿا. جيڪڏهن مائڪروسڪوپ ۾ گهربل جزا موجود هجن، ته اهي زنده، بنا رنگ جا سيل ڏيکاري سگهن ٿا.

هي چونڊ نموني کي بنا رنگ جي برقرار رکي ٿي، پر موجود معلومات کي بدلائي ٿي. توهان ڪنهن حد يا حرڪت جي پيروي ڪري سگهو ٿا، بغير اهو ڄاڻڻ جي ته ڪنٽراسٽ ڪهڙي ماليڪيول پيدا ڪيو. جيڪڏهن سوال ماليڪيولر لوڪلائيزيشن جو هجي، ته ان جي بدران مناسب ليبلنگ طريقو چونڊيو.

نيوڪليئر DNA لاءِ، Invitrogen جو DAPI ۽ Hoechst رنگن جو مقابلو فڪس ٿيل سيلن سان DAPI جي عام استعمال کي وڌيڪ cell-permeant Hoechst 33342 کان ڌار ڪري ٿو، جيڪو زنده سيلن جي ليبلنگ لاءِ ترجيح ڏنو وڃي ٿو. ٻنهي لاءِ فلوريسنس سامان گهربل آهي. انهن مان ڪو به رنگين برائيٽ فيلڊ رنگ جو سڌو متبادل ناهي.

رنگ جي exposure ۽ illumination کي تجرباتي حالتون سمجهو. جڏهن سيلن جو رويو توهان جي ماپ هجي، ته رنگيل ۽ بنا رنگ جي تيارين جو مقابلو ڪريو.

ڳاڙهو سيل پاڻمرادو مرده سيل ناهي

SYTO 9 ۽ propidium iodide کي اڪثر گڏ ڪري بيڪٽيريل ميمبرين جي سالميت جو جائزو ورتو ويندو آهي. BacLight manual صحيح ميمبرين کي سائي staining ۽ خراب ٿيل ميمبرين کي ڳاڙهي staining سان لاڳاپيل ڪري ٿو. هن تشريح کي نموني لاءِ تصديق ڪرڻ ضروري آهي.

Rosenberg ۽ ساٿين جي 2019 جي هڪ مطالعي مسئلو واضح ڪيو. phosphate-buffered saline ۾ شيشي تي موجود 24-hour E. coli biofilms ۾، لڳ ڀڳ 96% سيل in situ propidium-iodide-positive نظر آيا. پر ليکڪن اندازو لڳايو ته گڏ ڪرڻ کان پوءِ 82% ڪلچر ڪرڻ لائق هئا. Confocal تصويرن ۾ ڳاڙهي رنگيل مواد جي هيٺان سائي اندرين حصن وارا سيل نظر آيا، جنهن مان گمراهه ڪندڙ سگنل ۾ extracellular nucleic acids جي ڪردار جو اشارو مليو.

اهي سيڪڙو مطالعي جي تيارين تي مختلف ماپن کي بيان ڪن ٿا، ڪنهن آفاقي correction factor کي نه. ڪارائتو سبق اهو آهي ته چيڪ ڪيو وڃي ته سگنل ڇا پيدا ڪيو. biofilm ۾، nucleic-acid dye خراب ٿيل سيلن جي اندر موجود مواد سان گڏ سيلن کان ٻاهر موجود مواد به معلوم ڪري سگهي ٿو. زنده هجڻ بابت نتيجي لاءِ، محقق مڪمل ڪندڙ ماپن جي سفارش ڪن ٿا، جهڙوڪ cultivation يا metabolic activity، ۽ ساڳئي وقت تسليم ڪن ٿا ته هر طريقي جون پنهنجون حدون آهن.

چيڪ ڪريو ته متبادل ۾ اصل ۾ ڇا شامل آهي

متبادل staining طريقي ۾ اڃا به ميٿيلين بليو شامل ٿي سگهي ٿو. Giemsa هڪ مثال آهي: Merck پنهنجي پراڊڪٽ کي azure-eosin-methylene-blue solution طور بيان ڪري ٿو، جيڪو رت ۽ bone-marrow smears سميت مختلف استعمالن لاءِ آهي. اهو مختلف نموني لاءِ مختلف طريقو ٿي سگهي ٿو، پر ميٿيلين بليو کي خارج ڪرڻ جي گهرج پوري نٿو ڪري.

جيڪڏهن ڪنهن مرڪب کي خارج ڪرڻ تجربو جو حصو آهي، ته تصويرن جو مقابلو ڪرڻ کان اڳ ريجنٽ جي سڃاڻپ ۽ فارموليشن چيڪ ڪريو. methyl blue، methylene blue، ۽ ساڳين نالن وارن رنگن بابت گائيڊ نالن جي فرقن کي بيان ڪري ٿو.

نتيجو استعمال ڪرڻ کان اڳ متبادل جي تصديق ڪريو

نئين طريقي لاءِ، نمائندا نمونا ۽ مناسب ڪنٽرول استعمال ڪندي ننڍو مقابلو ڪريو. جتي ممڪن هجي، مائڪروسڪوپ جون سيٽنگون هڪجهڙيون رکو. ريجنٽ جي فارموليشن، نموني جي تياري، exposure، ۽ اميجنگ جون حالتون رڪارڊ ڪريو ته جيئن وڌيڪ سٺي نظر ايندڙ تصوير کي رڳو پسند ڪرڻ بدران ان جي جاچ ڪري سگهجي.

ڪاميابي کي اصل سوال جي بنياد تي پرکيو. مورفولوجي لاءِ، ڏسو ته ڇا سيلن جون حدون ۽ ترتيب اڃا به سمجهڻ لائق آهن. نيوڪليئر ليبلنگ لاءِ، سگنل جي جڳهه ۽ پسمنظر جو جائزو وٺو. زنده هجڻ لاءِ، رڳو دلڪش رنگن جي ورهاست کان وڌيڪ ثبوت گهرو. ميٿيلين بليو staining ۽ ليبارٽري استعمالن بابت وسيع گائيڊ بيان ڪري ٿو ته مشاهدو ۽ تياري ڪيئن گڏ ڪم ڪن ٿا.

اهو متبادل چونڊيو جيڪو توهان جي گهربل ماپ کي برقرار رکي. رنگ نتيجي ۾ حاصل ٿيندڙ تصوير جي صرف هڪ خاصيت آهي.