ڇا ميٿيلين بليو مائٽوڪانڊريائي ڪامپليڪس III کي باءِ پاس ڪري سگهي ٿو؟ مطالعي جا نتيجا ڇو مختلف آهن

ٻن ليبارٽرين اهو سوال پڇيو ته ڇا ميٿيلين بليو روڪيل مائٽوڪانڊريائي ڪامپليڪس III کي باءِ پاس ڪري سگهي ٿو. هڪ جو جواب نه هو. ٻيءَ جو جواب ها هو. ٻنهي وٽ ڊيٽا هئي.

پهرئين مطالعي ۾، مائوس جي دماغ جي مائٽوڪانڊريا ۾، معلوم ٿيو ته هي رنگ ائين نٿو ڪري سگهي. ٻئي مطالعي ۾، ڪتريندڙ جانورن جي ٽن قسمن جي دماغي مائٽوڪانڊريا ۾، معلوم ٿيو ته اهو جزوي طور ائين ڪري سگهي ٿو. مائوس جي جگر تي ڪيل ٽيون مطالعو اڪثر انهن سان گڏ حوالو ڏنو ويندو آهي، پر ان ۾ ڪنهن ٻي ڳالهه جي جاچ ڪئي وئي هئي. ان کي پنهنجي درست جاءِ تي رکو ته اڌ مونجهارو ختم ٿي وڃي ٿو.

هتي ڪنهن سڀني حالتن تي لاڳو ٿيندڙ عمل جي طريقي جو اعلان نٿو ڪري سگهجي. هتي ٽي تجربا آهن، جن ۾ روڪيندڙ مادّا، مقدار ۽ ماپيل نتيجا مختلف آهن. پهرين حالتون پڙهو. نتيجا انهن مان ئي نڪرن ٿا.

هتي باءِ پاس جو مطلب ڇا آهي

اليڪٽران ڪامپليڪس I ذريعي (NADH مان) يا ڪامپليڪس II ذريعي (سڪسينَيٽ مان) زنجير ۾ داخل ٿين ٿا، ڪامپليڪس III مان گذري سائيٽوڪروم c تائين پهچن ٿا، پوءِ ڪامپليڪس IV مان گذري آڪسيجن تائين وڃن ٿا. هن رستي ۾ ٺهندڙ گريڊيئنٽ کي خَليو ATP ٺاهڻ لاءِ استعمال ڪري ٿو.

باءِ پاس جي دعويٰ جو مطلب آهي ته ميٿيلين بليو رڪاوٽ کان اڳ اليڪٽران وٺي ٿو ۽ رڪاوٽ کان پوءِ انهن کي ڏئي ٿو. آڪسائيڊ ٿيل رنگ NADH يا زنجير جي شروعاتي حصن مان اليڪٽران وٺي ليوڪوميٿيلين بليو بڻجي ٿو، ۽ هي تخفيض ٿيل روپ انهن کي سائيٽوڪروم c ڏانهن يا واپس زنجير ۾ منتقل ڪري ٿو. جيڪڏهن منتقلي رڪاوٽ کان پوءِ ٿئي ٿي، ته تنفس ۽ جھليءَ جو پوٽينشل جزوي طور بحال ٿين ٿا. جيڪڏهن اها رڪاوٽ واري هنڌ يا ان کان اڳ ٿئي ٿي، ته ڪا بحالي نٿي ٿئي.

ڪامپليڪس III جي هڪ تفصيل هن اختلاف جي وڏي حصي جو فيصلو ڪري ٿي. هي ڪامپليڪس Q چڪر هلائي ٿو، جنهن ۾ روڪيندڙ مادّن جي ڳنڍجڻ جا ٻه هنڌ آهن. اينٽيمائسن Qi هنڌ سان ڳنڍجي ٿو. مائڪسوٿيازول Qo هنڌ سان ڳنڍجي ٿو. جيڪو مطالعو انهن مان رڳو هڪ استعمال ڪري ٿو، اهو ڪامپليڪس جي رڳو اڌ حصي جي جاچ ڪري ٿو.

پهريون مطالعو: مائوس جي دماغي مائٽوڪانڊريا ۾ باءِ پاس نه ٿيو

Gureev ۽ ساٿين C57BL/6 مائوس جي دماغي ڪارٽيڪس مان مائٽوڪانڊريا استعمال ڪيا، جيڪي ڊيجيٽونن سان الڳ ڪيا ويا هئا ۽ 0.1 mg پروٽين per ml تي جاچيا ويا. سبسٽريٽن جون ٽي حالتون هيون: پائروويٽ ۽ ماليٽ، هر هڪ 5 mM؛ سڪسينَيٽ 10 mM سان گلوٽاميٽ 2 mM؛ ۽ L-پرولين 10 mM. روڪيندڙ مادّا روٽينون 1 micromolar (ڪامپليڪس I) ۽ اينٽيمائسن 1 microgram per ml (ڪامپليڪس III) هئا. رنگ جا مقدار 0.5، 1 ۽ 2 micromolar هئا، جن ۾ 1 micromolar مکيه ڪنسنٽريشن هئي. طريقا ۽ رڪارڊ ڪيل وکر FEBS Letters جي مختصر مقالي ۾ آهن.

ڪامپليڪس I جو باءِ پاس ڪم ڪيو. روٽينون، ADP سان تحريڪ ڏنل تنفس کي لڳ ڀڳ 121 مان گهٽائي لڳ ڀڳ 2 nmol per minute per mg ڪيو، ۽ 1 micromolar رنگ ان کي لڳ ڀڳ 21 تائين بحال ڪيو. پائروويٽ ۽ ماليٽ تي، ۽ L-پرولين تي، جھليءَ جو پوٽينشل بحال ٿيو.

ڪامپليڪس III جو باءِ پاس ڪم نه ڪيو. اينٽيمائسن تنفس کي گهٽائي لڳ ڀڳ 16 ڪيو، ۽ رنگ ان کي رڳو لڳ ڀڳ 20 تائين وڌايو. ڪنهن به سبسٽريٽ تي، رنگ جي 5 micromolar تائين مقدار سان، جھليءَ جو پوٽينشل بحال نه ٿيو. پرآڪسائيڊ جي ڊيٽا به ساڳيو اشارو ڏنو: رڳو رنگ شامل ڪرڻ سان پرآڪسائيڊ جو اخراج لڳ ڀڳ 76 pmol per minute per mg جي بنيادي شرح مان وڌي، ٽن مقدارن تي، ترتيبوار لڳ ڀڳ 1170، 1460 ۽ 1945 ٿيو؛ پر اينٽيمائسن رنگ سبب پيدا ٿيل انهيءَ سگنل کي ترتيبوار لڳ ڀڳ 25، 88 ۽ 96 percent گهٽايو. جيڪڏهن تخفيض ٿيل رنگ سڌو آڪسيجن سان ردعمل ڪري ها، ته ڪامپليڪس III کي روڪڻ سان سگنل دٻجڻ نه گهرجي ها. ليکڪن اهو نتيجو ڪڍيو ته تخفيض ٿيل رنگ، اينٽيمائسن جي رڪاوٽ کان اڳ، ڪامپليڪس III جي Qo هنڌ تي آڪسائيڊ ٿئي ٿو. مختصر چڪر لفظن ۾ هي آهي: اليڪٽران ڏيندڙن کان رنگ ڏانهن، رنگ کان Qo ڏانهن، پوءِ معمول جي رستي سان اڳتي. روٽينون کي باءِ پاس ڪيو وڃي ٿو. اينٽيمائسن کي نه.

ٻيو مطالعو: ٽن قسمن ۾، روڪيندڙ مادّن جي ٻنهي هنڌن تي جزوي باءِ پاس

Svab ۽ ساٿين تجرباتي جوڙجڪ کي وڌيڪ وسيع ڪيو. مائوس، ريٽ ۽ گني پگ جي دماغن مان مائٽوڪانڊريا، Percoll سان الڳ ڪري، ساڳئي 0.1 mg per ml تي جاچيا ويا؛ سبسٽريٽ پائروويٽ ۽ ماليٽ يا گلوٽاميٽ ۽ ماليٽ هئا، هر هڪ 5 mM. انهن ڪامپليڪس III جا ٻه روڪيندڙ مادّا استعمال ڪيا: اينٽيمائسن A، 0.3 micromolar، ۽ مائڪسوٿيازول، 1 micromolar. اڪثر جاچن ۾ رنگ 2 micromolar هو، ۽ سائيٽوڪروم c واري ڪم ۾ 0.5 هو. ساڳين پروٽوڪولن سان ٽنهي قسمن جا نتيجا هن کليل رسائي واري مقالي ۾ آهن.

ٽنهي قسمن ۾ ٻنهي رڪاوٽن کي جزوي طور باءِ پاس ڪيو ويو. مائوس جي مائٽوڪانڊريا ۾ اينٽيمائسن تنفس کي دٻايو ۽ رنگ ان کي لڳ ڀڳ 60 percent وڌايو، يعني لڳ ڀڳ 37 مان 59 nmol per minute per mg تائين. مائڪسوٿيازول ان کي 88 percent گهٽائي لڳ ڀڳ 4.5 ڪيو، ۽ رنگ ان کي پنج ڀيرا وڌائي لڳ ڀڳ 23 ڪيو. ٻنهي روڪيندڙ مادّن سان جھليءَ جو پوٽينشل جزوي طور ٻيهر پولرائز ٿيو؛ ان کي ٻن رنگن، سيفرانن O ۽ تناسب تي ٻڌل TMRM، سان ماپيو ويو ته جيئن نوري ماپ جا مصنوعي اثر خارج ڪري سگهجن.

هن مقالي ۾ اليڪٽرانن جي منتقليءَ کي سڌو به جاچيو ويو، جيڪا پهرئين مطالعي ۾ ڪڏهن نه ڪئي وئي هئي. ٻاهران شامل ڪيل ايسيٽائليٽ ٿيل سائيٽوڪروم c، 25 micromolar تي، توانائيءَ واري حالت ۾ موجود مائٽوڪانڊريا سان تخفيض نه ٿيو، پوءِ روڪيندڙ مادّا موجود هجن يا نه؛ پر رنگ شامل ڪرڻ سان ٻنهي حالتن ۾ تخفيض ٿي. خَليَن کان سواءِ بفر ۾، NADH ۽ رنگ گڏجي سائيٽوڪروم c کي اهڙي شرح سان تخفيض ڪيو جيڪا NADH جي تناسب سان هئي. وڌيڪ ڊگهو ٽپو لفظن ۾ هي آهي: تخفيض ڪندڙ برابر مقدار رنگ ڏانهن، رنگ سڌو سائيٽوڪروم c ڏانهن، پوءِ ڪامپليڪس IV ذريعي آڪسيجن ڏانهن. هي رستو ڪامپليڪس III کي مڪمل طور ڇڏي اڳتي وڃي ٿو، تنهنڪري ٻنهي روڪيندڙ مادّن کي باءِ پاس ڪري سگهجي ٿو.

ٻه اضافي ماپون هن تشريح جي تائيد ڪن ٿيون. مائڪسوٿيازول سان عمل ڪيل مائٽوڪانڊريا ۾ رنگ شامل ڪرڻ تي NAD(P)H جي فلوريسنس گهٽجي وئي، جنهن جو مطلب هو ته تخفيض ڪندڙ برابر مقدار نئين رستي ذريعي نڪري رهيا هئا. رنگ جي 660 nm تي جذب هر نئين اضافي سان گڏ تبديل ٿيندو رهيو، جڏهن ته سينٽريفيوج ڪرڻ کان پوءِ مٿين مايع حصن مان ظاهر ٿيو ته آڪسائيڊ ٿيل رنگ توانائيءَ واري حالت ۾ موجود مائٽوڪانڊريا اندر سؤ ڀيرا کان وڌيڪ گڏ ٿيو، ۽ پوءِ پوٽينشل ختم ٿيڻ تي ٻاهر نڪري ويو. پروٽانن جو حساب به ٺهڪي اچي ٿو: پمپنگ وارن مرحلن کي ڇڏڻ سان هر اليڪٽران جوڙي لاءِ 10 بدران لڳ ڀڳ 2 پروٽان رهن ٿا، تنهنڪري آڪسيجن جو وڌيڪ تيز استعمال ۽ رڳو جزوي ٻيهر پولرائيزيشن ئي حقيقي باءِ پاس جي نشاني آهن، ان جي خلاف ثبوت نه.

ساڳئي تياريءَ اهڙا ردعمل پيدا ڪيا، جيڪي سرسري پڙهڻ کي گمراهه ڪن ٿا. روڪيندڙ مادّي ۽ رنگ جي موجودگيءَ ۾، ADP تنفس کي وڌائڻ بدران گهٽايو، ۽ ٽرانسپورٽ کي روڪڻ ان کي سست ڪرڻ بدران تيز ڪيو، جڏهن ته جھليءَ جو پوٽينشل اڃا به معمول وارين رخن ۾ تبديل ٿيو. هن نظام ۾ رڳو آڪسيجن جو استعمال گمراهه ڪري ٿو.

ٽيون مطالعو: جگر وارو مطالعو، جنهن ڪامپليڪس I ۽ II جاچيا، III نه

Lee ۽ Boelsterli مائوس جي جگر جا مائٽوڪانڊريا ۽ ڪلچر ۾ وڌايل جگر جا خَليا استعمال ڪيا، جن کي ايفاوِرينز (ڪامپليڪس I، IC50 لڳ ڀڳ 30 micromolar) ۽ هائيڊرازين، جيڪو آئيزونائيازيد جو ميٽابولائٽ آهي (ڪامپليڪس II، IC50 لڳ ڀڳ 30 micromolar)، سان نقصان پهچايو ويو هو. لڳ ڀڳ 30 micromolar رنگ NADH جي آڪسائيڊيشن، جھليءَ جي پوٽينشل ۽ ATP کي بحال ڪيو، جڏهن ته آڪسائيڊ ڪندڙ مادّا ۽ نيڪروسس واري خَليائي موت گهٽايا. Redox Biology جو مقالو ان کي اهڙي نموني پيش ڪري ٿو، جنهن ۾ رنگ اليڪٽرانن کي نقصان پهتل ڪامپليڪس I ۽ II جي چوڌاري کڻي وڃي ٿو.

اهو نتيجو زنجير جي اڳئين حصي بابت مڃيل پسمنظر آهي، ۽ ڪامپليڪس III بابت ڪجهه نٿو ٻڌائي، ڇاڪاڻ⁠تہ ان مطالعي ۾ اتي ڪا رڪاوٽ وڌي ئي نه وئي هئي. اهو دماغ وارن ٻنهي مطالعي مان ڪنهن جي به تصديق يا ترديد نٿو ڪري سگهي.

حالتن جو جدول

چار سبب، جن جي ڪري ڪامپليڪس III جا ٻئي مطالعو پنهنجي پنهنجي حالتن بابت درست ٿي سگهن ٿا

1. روڪيندڙ مادّي سان مداخلت ساڳي نه هئي. هڪ پاسي رڳو اينٽيمائسن 1 microgram per ml تي، ۽ ٻئي پاسي اينٽيمائسن 0.3 micromolar تي، گڏوگڏ Qo هنڌ جو هڪ الڳ روڪيندڙ مادّو. رنگ جو اهو رستو جيڪو اليڪٽران Qo هنڌ تي پهچائي ٿو، بلڪل انهيءَ جاءِ تي ناڪام ٿئي ٿو جتي سڌو سائيٽوڪروم c ڏانهن ويندڙ رستو ڪامياب ٿئي ٿو. هڪ هنڌ ٻنهي جي نمائندگي نٿو ڪري سگهي.

2. رنگ جو مقدار ۽ وقت مختلف هئا. مکيه ڪنسنٽريشن 1 ۽ 2 micromolar هئي، اهڙي ريڊاڪس چڪر هلائيندڙ مادّي لاءِ، جنهن جو اندر داخل ٿيڻ ۽ سڌو سائيٽوڪروم c کي تخفيض ڪرڻ ڪنسنٽريشن ۽ وقت تي دارومدار رکي ٿو. مقدار ۾ ننڍا فرق ۽ ماپ جي وقت ۾ فرق، هڪ ئي نيٽ ورڪ جا مختلف حصا ظاهر ڪري سگهن ٿا.

3. تياريون مختلف هيون. ڊيجيٽونن سان الڳ ڪرڻ ۽ Percoll گريڊيئنٽ سان الڳ ڪرڻ، مائٽوڪانڊريا جا اهڙا گروهه چونڊين ٿا جيڪي ڪجهه حد تائين ساڳيا، پر مڪمل طور هڪجهڙا نه آهن. پروٽين جي ڪنسنٽريشن ٻنهي ۾ 0.1 mg per ml هئي، تنهنڪري اهو متغير خارج ٿي وڃي ٿو، پر ذيلي گروهه ۽ ساختي سلامتِي نه. جانور جي قسم بابت شڪ به دور ٿي ويو: ٻئي گروهه پنهنجو مشاهدو مائوس ۾ به ورجايو.

4. سبسٽريٽ جي حالت طئي ڪري ٿي ته رنگ ڇا ڪري سگهي ٿو. هڪ پاسي سبسٽريٽ جون ٽي حالتون، ٻئي پاسي NADH سان ڳنڍيل جوڙا. NADH جي فراهمي ۽ جھليءَ جو پوٽينشل گڏجي طئي ڪن ٿا ته رنگ ڪيتري تيزيءَ سان تخفيض ٿئي ٿو ۽ ڪٿي ورهائجي ٿو؛ جنهن رستي کي آڪسائيڊ ٿيل سائيٽوڪروم c جي ڀرسان تخفيض ٿيل رنگ گهرجي، اهو هن چونڊ تي دارومدار رکي ٿو.

باءِ پاس جي ايندڙ دعويٰ کي ڪيئن پڙهجي

پڇو ته ڪهڙو ڪامپليڪس روڪيو ويو، ڪهڙي روڪيندڙ مادّي سان، ڪهڙي هنڌ تي ۽ ڪهڙي مقدار ۾. رنگ جي ڪنسنٽريشن ۽ ماپ وٺڻ جو وقت پڇو. ٽشو، جانور جو قسم، الڳ ڪرڻ جو طريقو، پروٽين جي ڪنسنٽريشن ۽ سبسٽريٽ پڇو. اهو به پڇو ته پوٽينشل، تنفس، ريڊاڪس حالت ۽ سڌي منتقليءَ جي جاچ هڪٻئي سان متفق آهن يا نه، ڇاڪاڻ⁠تہ هتي رڳو آڪسيجن جي استعمال هڪ کان وڌيڪ ڀيرا غلط رخ ڏيکاريو.

محدود خلاصو برقرار رهي ٿو. رنگ سان ڪامپليڪس I جي چوڌاري باءِ پاس تي اتفاق آهي. ڪامپليڪس III جي حوالي سان، مائوس جي مائٽوڪانڊريا ۾ اينٽيمائسن 1 microgram per ml ۽ رنگ 1 micromolar تي ڪو ڪارڪردگيءَ وارو باءِ پاس نظر نٿو اچي؛ جڏهن ته ٽن قسمن ۾ اينٽيمائسن 0.3 micromolar يا مائڪسوٿيازول 1 micromolar ۽ رنگ 2 micromolar تي، رنگ کان سائيٽوڪروم c ڏانهن سڌي منتقليءَ سان جزوي باءِ پاس نظر اچي ٿو. اهي ٻئي بيان گڏ درست ٿي سگهن ٿا. ان کان وڌيڪ وسيع نتيجو موجود ثبوتن کان اڳتي ڪڍيل اندازو آهي.

لاڳاپيل پڙهڻ هن تڪراري دعويٰ کي غيرتڪراري ڪيميا جي حدن اندر رکي ٿو: اليڪٽرانن جي مرحليوار منتقليءَ لاءِ ميٿيلين بليو اليڪٽران ڪيئن منتقل ڪري ٿو، زنجير جي اڳئين حصي بابت مڃيل نتيجي لاءِ ڪامپليڪس I جي باءِ پاس جا تجربا، ٻن رنگن جي ضرورت ڇو هئي، ان لاءِ جھليءَ جي پوٽينشل جون ماپون ۽ انهن جا مصنوعي اثر، ۽ مقدار ۽ وقت جي چونڊ ۾ ممڪن غلطين لاءِ ليبارٽري ۾ ريڊاڪس چڪر هلائيندڙ مادّن سان ڪم ڪرڻ جا طريقا.