Статья
Окрашивание метиленовым синим: методы микроскопии и атлас реальных изображений
Окрашивание метиленовым синим делает иначе слабо различимые клеточные структуры более заметными при светлопольной микроскопии. Оно может помочь студентам найти ядро клетки щеки или изучить контуры и расположение микроорганизмов. Однако синий объект — это наблюдение. Название организма, его измерение и решение о том, указывает ли он на заболевание, являются отдельными задачами.
На обложке показан принцип контраста. Атлас ниже содержит реальные фотографии независимо документированных образцов с исходной информацией об источниках.
Что выявляет метиленовый синий?
Метиленовый синий — это основной краситель: его окрашенный ион несёт положительный заряд. Как объясняет OpenStax в разделе о окрашивании образцов, основные красители взаимодействуют с отрицательно заряженным клеточным материалом и могут выделять клетки на фоне более светлого окружения. В подходящих препаратах метиленовый синий подчёркивает области, богатые нуклеиновыми кислотами, и другие структуры, связывающие краситель.
При простом окрашивании один краситель создаёт контраст. Поэтому несколько организмов могут выглядеть синими, не являясь одним и тем же организмом. Изначально полезны описательные вопросы: являются ли объекты круглыми или вытянутыми, изолированными или сгруппированными, равномерно окрашенными или внутренне различающимися? Ознакомьтесь с различием между простым окрашиванием и окрашиванием по Граму перед тем, как интерпретировать цвет как результат классификации.
Контраст и разрешение — это разные понятия. Контраст помогает отличить объект от окружения; разрешение позволяет разделить близко расположенные детали. Более тёмное изображение не гарантирует наличия большего количества различимых структур. Также не каждая тёмная гранула заслуживает обозначения как органелла.
Нативные препараты, окрашенные влажные препараты и мазки
Неокрашенный, или нативный, влажный препарат сохраняет изображение без добавления красителя, хотя удаление образца из исходной среды всё равно изменяет его. Окрашенный влажный препарат добавляет реагент, пока материал остаётся в жидкости под покровным стеклом. Фиксированный мазок распределяет материал на предметном стекле и использует определённый метод фиксации перед дальнейшей обработкой. Обзор подготовки образцов OpenStax различает влажные препараты и фиксацию и объясняет, почему фиксированные организмы больше не показывают нормальное движение или метаболизм.
Эти препараты отвечают на разные вопросы:
| Подготовка | Полезное наблюдение | Что изображение само по себе не может установить |
|---|---|---|
| Нативный влажный препарат | Движение, контуры, естественно видимый материал | Идентичность только по движению или форме |
| Окрашенный влажный препарат | Контраст между структурами, связывающими краситель, и окружающей средой | Изменилась ли нормальная физиология под воздействием реагента |
| Фиксированный окрашенный мазок | Морфология, сохранённая после определённой подготовки | Как вёл себя исходный живой образец |
| Именованный дифференциальный метод | Определённая реакция окрашивания с соответствующими контролями | Видовая принадлежность или заключение без более широких доказательств метода |
Для учебного сравнения зафиксируйте неокрашенный препарат перед изучением отдельно окрашенного препарата, подготовленного в соответствии с учебным протоколом. Сохраняйте сопоставимые настройки освещения и получения изображения. Если фотографируются две разные клетки, описывайте их как примеры, а не как запись до и после одной клетки.
Атлас микроскопии: три реальных окрашенных образца
Этот атлас представляет собой оригинальную подборку и интерпретацию трёх открыто лицензированных микрофотографий. Авторы источников указывают образцы и красители. Мы не проводили независимую проверку их образцов. Изображения воспроизведены без обрезки в виде конверсий WebP без потерь, без добавленных элементов или изменений цвета.
Пластина 1: клетки щеки человека
Образец: клетки щеки человека. Краситель: метиленовый синий. Увеличение: 400×, указано фотографом. Масштабная линейка: недоступна; источник не предоставляет откалиброванный размер пикселя. Фотография Fritzmann2002, 2017, из Human Cheek Cells (Methylene Blue Stain), лицензия CC BY-SA 4.0. Эта репродукция сохраняет указанную лицензию.
.jpg){kind=link}
Начните с отдельной клетки: её более тёмное ядро легче отличить от окружающей синей цитоплазмы. Затем изучите расположенные ниже перекрывающиеся клетки. Перекрытие затрудняет отслеживание границы и может создавать локально более тёмную область. Используйте эту пластину для практики обведения контуров, а не для подсчёта каждого тёмного участка как ядра. Руководство по наблюдению клеток щеки развивает упражнение, связанное с этим образцом.
Пластина 2: клетки лука
Образец: клетки лука, согласно идентификации источника. Краситель: метиленовый синий. Увеличение: «200x» указано в исходном имени файла; оно не проверено независимо. Масштабная линейка: недоступна; калибровка не предоставлена. Фотография Alvy16, 2019, из Onion cell 200x, лицензия CC BY 4.0.
Вытянутые отделения образуют организованный слой. Сравните их длинные общие границы с неправильными контурами на пластине 1. Также обратите внимание на заметный тёмный материал и неравномерную яркость поля. Фотография не устанавливает идентичность каждого тёмного отложения. Она показывает, почему полезная запись наблюдений включает артефакты и неопределённость вместо маркировки всего, что поглощает цвет.
Пластина 3: дрожжи, идентифицированные источником как Candida spp.
Образец: Candida spp., согласно фотографу. Краситель: простое позитивное окрашивание метиленовым синим. Увеличение: недоступно. Масштабная линейка: недоступна; откалиброванный размер пикселя не предоставлен. Фотография Marta, пользователя Wikimedia Martunia.g, 2021, из Positive staining with methylene blue 2, лицензия CC BY 4.0.
Сравните плотные синие скопления с менее заполненными краями. Отдельные контуры легче проследить там, где объекты меньше перекрываются. Название Candida взято из записи источника, а не является результатом идентификации вида по этой фотографии. Эта пластина также не содержит данных о жизнеспособности. Анализы жизнеспособности дрожжей и дыхания требуют собственных условий, контролей и интерпретации.
Правильное чтение масштаба
Эти пластины позволяют проводить визуальное сравнение, но не измерения в микрометрах или сравнение абсолютного размера клеток между пластинами. Указанное увеличение не восстанавливает отсутствующую калибровку камеры. Изменение размера отображения изображения изменяет его видимое увеличение.
Для собственных изображений установите калибровку измерений с использованием известного стандарта и соответствующей оптической системы. Руководство Nikon по микрометрии объясняет, как объект-микрометр преобразует произвольные деления изображения или окулярной шкалы в физические длины. Записывайте объектив, конфигурацию камеры и калибровку, а затем добавляйте масштабную линейку на основе этих данных. Не выводите масштабную линейку из среднего размера клеток в учебнике.
Соответствует ли флакон методу?
Флакон с маркировкой «метиленовый синий» не является полной лабораторной спецификацией. Проверьте его концентрацию и единицы измерения, растворитель, дополнительные ингредиенты, предполагаемое применение, документацию партии и инструкции. Паспорт безопасности реагента описывает опасности; инструкции метода устанавливают, как использовать его для предназначенной подготовки.
Конкретным примером является раствор метиленового синего Лёффлера Merck. Производитель указывает его как реагент для микроскопии и описывает его роль как контрастного красителя при кислотоустойчивом окрашивании. Указанная воспламеняемость также показывает, почему «синяя жидкость» недостаточна для планирования обращения или нагревания. Эти свойства относятся к данной формуле, а не автоматически ко всем водным растворам метиленового синего.
Аналогично, эозин-метиленовый синий агар является составной питательной средой. Это не краситель для предметного стекла, приготовленный добавлением обычного метиленового синего к образцу. Для другой цели визуализации сравните альтернативы метиленовому синему для микроскопии.
Для начинающего набора микроскопа начните с документированного учебного метода, известных подготовленных препаратов и указанного реагента. Если флакон потерял маркировку или его состав невозможно установить, замените его подходящим документированным реагентом. Используйте защиту глаз и инструкции по обращению, предоставленные для фактической формулы. Материал человека и неизвестные образцы окружающей среды требуют процедур обращения с образцами и утилизации учебной лаборатории; окрашивание не заменяет эти процедуры.
Запишите наблюдение до вывода
«Синие овальные объекты в скоплениях» — это обоснованное описание изображения. «Определённая инфекция» требует доказательств, которых изображение не предоставило. Храните отдельно происхождение образца, подготовку, реакцию окрашивания и метод идентификации в лабораторном журнале. Такое различие делает простое учебное изображение полезным и не позволяет привлекательной микрофотографии нести утверждение, которое она не может подтвердить.