Метиленовый синий в исследованиях данио: добавка для содержания и экспериментальный фактор смешения

Вода для икры данио часто имеет слабый синий оттенок, и почти никто не записывает причину. Этот краситель — метиленовый синий, добавляемый против грибка, и большинство протоколов рассматривают его как фон. Фон — неправильное понятие в данном случае. Более точное понятие — незарегистрированный экспериментальный фактор: вещество, присутствующее в обработанных чашках и отсутствующее в контролях, фармакологически активное в используемых концентрациях и способное изменять именно те показатели, которые измеряет эксперимент.

Это различие организует всё дальнейшее обсуждение. Обычное противогрибковое содержание — один вопрос. Нейтральна ли добавка по отношению к вашему анализу — другой. Современная литература по данио отвечает на первый вопрос обнадёживающе, а на второй — менее комфортно.

Что на самом деле предписывают руководства

Единого стандарта нет, и это является частью проблемы. Руководство Canadian Council on Animal Care допускает 0.5 mg/L, или 0.00005%, в растворе для транспортировки икры и личинок для снижения роста грибков. Европейские рекомендации по лабораторным животным описывают содержание эмбрионов в среде, часто содержащей те же 0.00005%. Рецепт E3 от Cold Spring Harbor указывает вдвое большее количество — 1 mg/L или 0.0001% — как ингредиент рецепта. На этом фоне заметно отсутствие: руководство OECD по тесту токсичности на эмбрионах рыб указывает восстановленную воду для разведения и тестируемое химическое вещество, но не рекомендует метиленовый синий ни в версии 2013 года, ни в более поздней редакции. Таким образом, одна лаборатория выращивает эмбрионы данио в синей воде с метиленовым синим с первых часов жизни, другая проводит регуляторный тест эмбрионов в прозрачной воде, и обе считают свою среду нормальной. Любой, кто сравнивает результаты между лабораториями или объединяет исторические контроли, наследует эту несогласованность.

Для понимания концентраций: 0.00005% — это примерно 1.56 микромоляр, а 0.0001% — около 3.13 микромоляр. Это низкие значения, и возникает соблазн считать, что они слишком малы для влияния. Приведённые ниже исследования проверяют именно это предположение и именно при таких концентрациях.

Читатели, знакомые с содержанием рыб, а не с лабораторией, встречают ту же молекулу в другом контексте, описанном в руководстве по метиленовому синему для аквариума. Химия одинакова; обсуждение того, как краситель переносит электроны через клетки, объясняет, почему окислительно-восстановительно активное соединение постоянно появляется в работах по метаболизму. Далее рассматривается только вода для икры данио с метиленовым синим.

Метаболизм: эффект меняет направление в зависимости от стадии

Наиболее информативное исследование подвергало нормально развивающихся данио воздействию с первого дня жизни до 5 дней после оплодотворения и измеряло окислительный метаболизм на каждой стадии, как описано в опубликованном отчёте об экспериментах по метаболизму эмбрионов. Результат стоит изложить внимательно, потому что направление эффекта меняется.

На 1 день после оплодотворения базовое потребление кислорода увеличивалось у подвергшихся воздействию эмбрионов при обеих концентрациях, используемых для содержания. На 2 день мембранный потенциал митохондрий в поверхностном слое личинок повышался при воздействии 0.00005%, 0.0001% и 0.0003%. К 4–5 дню, после вылупления, направление изменилось: затраты окислительной энергии снижались независимо от того, продолжалось ли воздействие с момента оплодотворения или было кратковременным только с 3 по 4 день. Параллельно снижалась экспрессия транскриптов субъединиц митохондриальных дыхательных комплексов на 1 и 4 день, вместе с транскриптами, связанными со стероидогенезом и глюконеогенезом.

Два дополнительных наблюдения уточняют картину. При более высокой концентрации для содержания вылупление происходило немного раньше: обработанные эмбрионы опережали контроль на 2 день, а контроль догонял их к 3 дню. При этом сама стрессовая ось оставалась сохранной: когда личинки возрастом 5 дней подвергались воздействию вращающего стрессора, уровень кортизола во всём организме нормально повышался в обеих группах. Таким образом, при этих дозах краситель не является общим токсином развития и не подавляет каждую физиологическую реакцию. Он изменяет энергетический метаболизм в зависимости от стадии: повышая его до вылупления и снижая после него.

Поведение: почему два исследования расходятся и почему оба могут быть верными

Литература по поведению выглядит противоречивой, пока схемы воздействия не рассматриваются рядом. Одно исследование безопасности развития и поведения подвергало эмбрионы воздействию примерно с 6 часов после оплодотворения до концентраций до 10 микромоляр, ежедневно обновляло растворы до 4 дня, затем перемещало личинок в среду без красителя на 5 и 6 дни и тестировало движение в анализе свет–темнота на 6 день. Результат: отсутствие значимого влияния на смертность, вылупление или морфологию, а также отсутствие влияния обработки на движение. Авторы обоснованно рекомендовали 10 микромоляр как верхний предел при их условиях.

Вторая группа, частично совпадающая по составу авторов с исследованием метаболизма, проводила воздействие так, как оно происходит при содержании: краситель присутствовал с 2–3 часов после оплодотворения с ежедневным частичным обновлением, а поведение измерялось во время продолжающегося или недавнего воздействия. При тех же стандартных концентрациях личинки демонстрировали снижение движения в 24-часовом анализе, воспроизводимое между линиями и лабораториями, а исследование поведенческого смешения связывало эффект с серотонинергическим тонусом, что согласуется с известным ингибированием моноаминоксидазы этим красителем. Наиболее показательно, что среда для эмбрионов с метиленовым синим скрывала ожидаемую реакцию движения на СИОЗС флуоксетин. Таким образом, скрининговый анализ в синей воде может не обнаружить эффект препарата, который был бы выявлен в прозрачной воде.

Настоящего противоречия нет. Соединение может не оставлять обнаруживаемого эффекта через два дня после удаления в одном анализе и при этом быть активным во время присутствия в другом. Практический вывод таков: отрицательный результат после удаления вещества определяет верхнюю границу концентрации, но не доказывает нейтральность, тогда как положительный результат описывает важный риск: активное воздействие во время окна измерения в точной конфигурации, которую используют многие лаборатории.

Окислительно-восстановительный краситель внутри окислительно-восстановительного анализа

Есть ещё одна ловушка, заслуживающая отдельного абзаца, поскольку она искажает сам измерительный инструмент, а не животное. Анализ энергозатрат Alamar Blue сам основан на окислительно-восстановительной химии: ресазурин восстанавливается до флуоресцентного резоруфина. Метиленовый синий также участвует в окислительно-восстановительных реакциях. В бесклеточных контролях обе концентрации, используемые для содержания, немного, но значимо снижали флуоресценцию Alamar Blue через 24 часа. В экспериментах с животными обработанных эмбрионов промывали не менее трёх раз в среде без красителя перед анализом, и биологический эффект у вылупившихся личинок превышал бесклеточную интерференцию. Поэтому верны оба утверждения: промытые животные сохраняют реальный метаболический эффект, а непомытый краситель добавляет прямой химический артефакт. Контроли должны разделять эти два фактора, иначе ни одно число не имеет смысла. Общие рекомендации по интерпретации результатов анализов на основе красителей здесь особенно важны.

Временная шкала этапов развития

Исходный материал для этой статьи. Концентрации — два стандартных значения для содержания, 0.00005% и 0.0001%, если не указано иное.

Главная закономерность: раннее повышение и позднее снижение метаболических показателей, при этом поведенческие эффекты присутствуют во время воздействия и не обнаруживаются после выведения в единственном анализе, где это проверялось.

Контрольный список для дизайна эксперимента

Второй исходный материал для статьи. Используйте его, когда протоколы содержания данио с метиленовым синим пересекаются с экспериментом.

1. Указывайте краситель как реагент, а не как воду. Записывайте концентрацию в процентах и микромолярах, начало и конец воздействия в часах или днях после оплодотворения, график обновления и интервал удаления перед каждым измерением.
2. Подбирайте контроли под вопрос исследования. Исследованию тестируемого химического вещества нужны контроли без красителя; исследованию содержания нужны группы без красителя и с красителем с фиксацией противогрибкового результата, поскольку ни одно из указанных исследований не измеряло эффективность против грибка.
3. Промывайте перед окислительно-восстановительными анализами и проверяйте результат. Промывайте не менее трёх раз в среде без красителя и проводите бесклеточный контроль краситель плюс реагент, поскольку краситель напрямую снижает сигнал Alamar Blue.
4. Рассматривайте поведение и показатели моноаминов как высокорисковые. Исследования движения, стартл-реакции, тревогоподобного поведения, антидепрессантов и ингибирования МАО должны избегать красителя во время измерения или демонстрировать нейтральность для конкретного показателя; удаление на один–два дня устранило один эффект движения, но это не доказано для других парадигм.
5. Рассматривайте метаболические и митохондриальные показатели как высокорисковые на каждой стадии. Потребление кислорода, энергозатраты, мембранный потенциал и транскрипты дыхательной цепи изменяются при концентрациях для содержания, причём в противоположных направлениях до и после вылупления.
6. Не переносите нейтральность между разными дизайнами. Отрицательный результат после удаления вещества не распространяется на продолжающееся воздействие; отсутствие морфологических эффектов не исключает влияния на метаболизм или взаимодействие препаратов; результат для одной линии, температуры или длительности анализа не распространяется на другие условия.
7. Указывайте использованное руководство и его альтернативы. Явно называйте концентрации CCAC, европейских рекомендаций или Cold Spring Harbor и отмечайте, что тест эмбрионов рыб OECD исключает краситель, чтобы читатель мог определить положение вашего эксперимента.

Ничто из этого не выступает против использования красителя для сохранения икры. Это аргумент против того, чтобы выбор при содержании попадал в данные без проверки. Синий цвет в чашке — это молекула с фармакологическими свойствами, и эксперименты, наиболее вероятно искажаемые ей, — именно высокопроизводительные метаболические и нейроповеденческие скрининги, для которых молодые данио сейчас широко используются. Записывайте его наличие, контролируйте его, удаляйте его перед измерением и проверяйте анализ, в котором он может незаметно участвовать.