Метиленовый синий и прогерия: уроки из модели клеточного старения

Изменение всего одной буквы в одном гене заставляет детей стареть с пугающей скоростью. Выпадение волос, тугоподвижность суставов, сужение артерий и продолжительность жизни в подростковом возрасте. Это синдром прогерии Хатчинсона — Гилфорда, и на протяжении многих лет его исследование было сосредоточено на ядре, где мутантный белок наносит повреждения. В исследовании 2016 года из Университета Мэриленда был задан другой вопрос: как выглядят митохондрии в этих клетках? Ответ связал два клеточных компартмента, а столетний синий краситель оказался связан с обоими.

Исследование Xiong и коллег было опубликовано в Aging Cell в 2016 году. Оно полностью проводилось с культивируемыми клетками. Этот факт определяет всё последующее изложение. Полученные результаты являются достоверными и конкретными. Их удалённость от любого лечения столь же конкретна.

Модель: одна мутация, один липкий белок

Прогерия начинается с замены C на T в позиции 1824 гена LMNA. Это изменение не меняет аминокислоту. Оно активирует скрытый сайт сплайсинга, в результате чего из белка ламин A удаляются 50 аминокислот. Укороченный продукт, называемый прогерином, теряет участок расщепления, который обычно позволяет клетке удалять его фарнезильный якорь. Поэтому прогерин остаётся постоянно фарнезилированным и прикреплённым к внутренней ядерной мембране, где нормальный ламин A обычно циклически присоединяется и отсоединяется.

Последствия для ядра хорошо изучены и видны под микроскопом. Ядра образуют выпячивания и складки вместо сохранения гладкой овальной формы. Гетерохроматин, плотно упакованная неактивная ДНК, которая обычно располагается у края ядра, истончается. Тысячи генов меняют уровень экспрессии. Представьте ядерную ламинную оболочку как каркас за обоями: когда один элемент каркаса приварен в неправильном положении, стена выпирает, а рисунок обоев искажается во всей комнате.

В исследовании использовались кожные фибробласты пациентов с прогерией вместе с контрольными клетками, соответствующими по числу пассажей, а также вторая линия, созданная так, чтобы нормальные фибробласты напрямую производили прогерин. В созданных клетках развились те же дефекты, что указывает на прогерин как причину, а не на историю пациентов или время культивирования. Выраженность изменений зависела от количества: линия с более высокой экспрессией прогерина демонстрировала более серьёзные дефекты.

Как выглядели митохондрии

Здоровые митохондрии фибробластов образуют разветвлённую околоядерную сеть — длинные трубчатые структуры, которые перемещаются вдоль цитоскелетных путей. В линиях прогерии эта сеть исчезала. Большая доля митохондрий была фрагментирована, многие были увеличены, а электронная микроскопия показала примерно двукратное увеличение числа сильно повреждённых органелл. Прижизненная визуализация показала, что они перемещались на меньшие расстояния с более низкой скоростью по сравнению с контролем.

Функция соответствовала форме. Уровни митохондриального супероксида и окислителей во всей клетке повышались. Больше клеток демонстрировало нарушение мембранного потенциала. Производство АТФ снижалось. Само по себе это не является неожиданным, поскольку повреждённые митохондрии выделяют активные формы кислорода и производят меньше энергии. Новым было предложенное объяснение причины. PGC-1alpha, транскрипционный коактиватор, который запускает биогенез митохондрий через такие нижестоящие факторы, как NRF1, TFAM, а также регуляторы слияния и деления MFN1, MFN2, OPA1, FIS1 и DRP1, был снижен примерно в восемь раз на уровне мРНК в клетках прогерии, с соответствующей потерей белка. Казалось, что прогерин подавляет главный переключатель создания и поддержания митохондрий. Эта связь между повреждением ядерной ламины и энергетическим обменом является частью более широкого описания производства энергии в митохондриях, а окислительная сторона того же баланса рассматривается в разделе об окислительном стрессе и контроле ROS.

Что изменил метиленовый синий

Исследователи обрабатывали клетки 100 наномолями метиленового синего, в низкой концентрации, непрерывно в течение нескольких недель. С точки зрения клеточной культуры это длительное мягкое воздействие, а не кратковременный импульс препарата. Метиленовый синий переключается между окисленной и восстановленной формами и может переносить электроны внутри митохондрий, поэтому его описывают как окислительно-восстановительное соединение, направленное на митохондрии, а не как обычный антиоксидант, который расходуется при нейтрализации одного окислителя.

Митохондрии реагировали как в нормальных, так и в клетках прогерии. Уровень АТФ повышался, уровни окислителей снижались, а доля сильно дефектных митохондрий уменьшалась. Экспрессия PGC-1alpha частично восстанавливалась вместе с некоторыми его нижестоящими мишенями. На этом этапе это общий эффект поддержки митохондрий, а не специфическое действие при прогерии.

Результаты для ядра были неожиданностью и были специфичны для больных клеток. Количество выпячиваний ядра уменьшилось при количественном анализе формы. Общее количество ламинов A и C увеличилось. Наиболее заметно было перераспределение прогерина: в необработанных клетках прогерии только около 30 процентов прогерина находилось в растворимой нуклеоплазматической фракции, а остальная часть была закреплена на мембране. После обработки доля растворимой формы выросла примерно до 65 процентов, приблизившись к поведению нормального ламина. Освобождённый от мембраны прогерин меньше увлекает за собой соседние структуры, и растворимые фракции ламинов A и C также восстанавливались.

После этого высвобождения улучшились два ядерных фенотипа. Околоядерный гетерохроматин, исследованный с помощью электронной микроскопии и окрашивания на белок гетерохроматина HP1-alpha, был заметно восстановлен. А секвенирование РНК показало возвращение транскриптома к нормальному состоянию: необработанные клетки прогерии отличались от контроля более чем по 3 200 генам, тогда как обработанные клетки прогерии отличались примерно по 1 670 генам. В нормальных клетках такое же воздействие изменяло только несколько десятков генов, что указывает на связь ядерного эффекта именно с прогерином, а не с общим резким изменением транскрипции. Принцип того, что клеточные и животные модели отвечают на более узкие вопросы, чем предполагают их заголовки, объясняется в статье как читать исследования метиленового синего.

Почему это не является лечением

Четыре ограничения удерживают это исследование там, где ему и место: внутри лаборатории.

Во-первых, всё происходило в чашках. Фибробласты в культуре лишены кровоснабжения, иммунного контекста, тканевой архитектуры и фармакологии всего организма, которая определяет, достигает ли соединение вообще своей мишени. В этой работе ни одно животное не получало дозу, и ни один пациент не проходил лечение.

Во-вторых, фибробласты при прогерии являются моделью одного типа клеток. Болезнь в основном приводит к повреждениям через артерии, кости и жировую ткань, а исследование проверяло только фибробласты и одну подготовку гладкомышечных клеток. Другие ткани могут вести себя иначе.

В-третьих, восстановление ядра происходило после недельного непрерывного воздействия наномолярной концентрации в культуральной среде. Концентрации в чашке не являются дозировками, и в статье нет преобразования 100 наномолей в среде в схему для человека. Метиленовый синий имеет собственную зависимость эффекта от дозы и профиль безопасности в других областях медицины, и это исследование не даёт оснований для самостоятельного применения. Общий контекст безопасности рассматривается в статье безопасность метиленового синего и побочные эффекты.

В-четвёртых, прогерия не является обычным старением. Это редкое заболевание с одной мутацией, при котором ядерный каркас повреждается определённым образом. Соединение, которое уменьшает такое специфическое повреждение в культивируемых клетках, мало говорит о старении людей без этой мутации. Клеточный фенотип является окном в связь между ядром и митохондриями, а не результатом исследования продолжительности жизни.

Справедливое резюме должно быть условным. В фибробластах при прогерии прогерин подавляет PGC-1alpha и оставляет митохондрии фрагментированными, менее подвижными, с повышенным уровнем окислителей и недостатком энергии. Метиленовый синий в низкой концентрации восстановил показатели работы митохондрий во всех клетках и дополнительно высвободил прогерин из ядерной мембраны в больных клетках, с частичным восстановлением формы ядра, гетерохроматина и экспрессии генов. Это двойное действие делает исследование важным для понимания. Оно не делает метиленовый синий терапией прогерии или старения.