Метиленовый синий и воспалительная сигнализация: инфламмасомы, IL-6 и STAT3

Представим, что три лаборатории сообщают об одном и том же синем соединении как о противовоспалительном. Одна показывает меньше IL-1beta в макрофагах. Другая показывает меньше фермента iNOS в том же типе клеток. Третья показывает меньше IL-6 в крови и меньшую активность STAT3 в мозге. Возникает соблазн объединить эти три результата в одно утверждение. Такое объединение скрывает суть находки.

Каждый результат относится к отдельной концепции сигнализации со своим триггером, этапом сборки и показателем измерения. Метиленовый синий взаимодействует с каждой концепцией на разных этапах. Улучшает ли что-либо из этого состояние здоровья — отдельный вопрос, рассматриваемый в нашем обзоре метиленового синего и воспаления. Эта страница посвящена только путям сигнализации.

Путь 1: сборка инфламмасом и каспаза-1

Инфламмасома — это белковый каркас, который собирается по требованию внутри миелоидной клетки. Его компоненты — сенсор, адаптер под названием ASC и эффекторный фермент каспаза-1. После сборки каспаза-1 расщепляет pro-IL-1beta и pro-IL-18 до их секретируемых форм и может запускать пироптоз — воспалительную форму гибели клетки. Сенсор определяет тип: NLRP3 реагирует на кристаллы и образующие поры токсины, такие как нигерицин и ATP, NLRC4 реагирует на бактериальный флагеллин, AIM2 реагирует на цитозольную двухцепочечную ДНК, а неканонический путь реагирует на внутриклеточный липополисахарид.

Активация требует двух сигналов. Первый сигнал — прайминг: лиганд Toll-подобного рецептора запускает зависимую от NF-kB транскрипцию NLRP3 и pro-IL-1beta, чтобы необходимые компоненты присутствовали. Второй сигнал — сборка: второй триггер вызывает олигомеризацию ASC в specks, расщепление каспазы-1 до фрагмента p20 и высвобождение зрелого IL-1beta p17. Известно, что митохондриальные активные формы кислорода и поглощение кристаллов участвуют во втором сигнале NLRP3.

Исследование макрофагов 2017 года по широкому ингибированию инфламмасом проверяло действие метиленового синего на обоих сигналах. В костномозговых макрофагах мышей, активированных липополисахаридом, нигерицин, ATP и кристаллы мононатриевого урата каждый вызывали высвобождение IL-1beta и каспазы-1, а также образование ASC specks, и метиленовый синий в концентрации от 20 до 200 микромоляр снижал все три показателя дозозависимым образом без гибели клеток. Флагеллин и Salmonella для NLRC4, двухцепочечная ДНК и Listeria для AIM2, а также трансфицированный липополисахарид или живые E. coli для неканонического пути показали ту же картину. Само соединение не вызывало высвобождения, а контрольные чашки не показали антибактериального эффекта, поэтому результат относится к ответу хозяина.

Выше по течению были измерены три воздействия. Индуцированный ротеноном митохондриальный супероксид снижался при добавлении метиленового синего, и вместе с ним снижалось вызванное ротеноном высвобождение IL-1beta. Поглощение флуоресцентных шариков снижалось, что соответствует уменьшению фагоцитоза до распознавания кристаллов. Репортер под контролем промотора NLRP3 с двумя сайтами NF-kB показывал меньшую активность с метиленовым синим, тогда как усечённый промотор без этих сайтов не реагировал. В бесклеточной пробирке метиленовый синий также напрямую снижал активность рекомбинантной человеческой каспазы-1. Добавление соединения только во время прайминга или только во время активации всё ещё уменьшало высвобождение IL-1beta, IL-18 и каспазы-1, поэтому задействованы оба этапа.

Исследования на мышах соответствовали этой избирательности. Летальная доза липополисахарида убивала контрольных животных в течение нескольких часов, тогда как метиленовый синий улучшал выживание; перитонеальный IL-1beta снижался, но IL-6 в той же жидкости — нет. В модели перитонита, вызванного Listeria, перитонеальный IL-1beta снижался, тогда как общее количество клеток не изменялось. Человеческие моноциты THP-1 вели себя как мышиные макрофаги для всех четырёх типов инфламмасом. Результат с инфламмасомой объясняет созревание IL-1beta и IL-18, но не каждого цитокина, поэтому форма иммунных клеток мозга в экспериментах с микроглией и астроцитами отвечает на другой вопрос, чем сборка каркаса.

Путь 2: транскрипция iNOS через связывание NF-kB и STAT1

Индуцируемая синтаза оксида азота, или iNOS, почти отсутствует в состоянии покоя и транскрибируется по требованию. Липополисахарид запускает её главным образом через деградацию IkB-alpha с последующим фосфорилированием NF-kB и его входом в ядро. Интерферон-гамма запускает её главным образом через фосфорилирование Janus-киназой STAT1 с последующим входом STAT1 в ядро. Затем каждый фактор связывается со своим участком промотора iNOS. Активность фермента и индукция гена являются отдельными контрольными точками, и лекарственное соединение может действовать на одну или обе.

Исследование индукции iNOS в макрофагах и мышах с эндотоксемией 2015 года поместило эффект на уровень сообщения. В клетках RAW 264.7 и первичных мышиных макрофагах 1 микромоляр метиленового синего, добавленный за 30 минут до липополисахарида, интерферона-гамма или обоих факторов, снижал белок и мРНК iNOS через 8–24 часа, с меньшим количеством нитрита в среде и без потери жизнеспособности. У мышей, получавших 25 мг на кг липополисахарида, одна доза 5 мг на кг за час до этого снижала белок и мРНК iNOS в лёгких, печени и сердце.

Отличительная деталь — то, что не изменилось. Деградация IkB-alpha, фосфорилирование NF-kB, фосфорилирование STAT1 и накопление в ядре каждого из факторов оставались неизменными. Изменение происходило одним этапом позже: ядерные экстракты показывали меньшее связывание NF-kB с его ДНК-элементом после липополисахарида и меньшее связывание STAT1 после интерферона-гамма, а хроматиновая иммунопреципитация подтверждала меньшее присутствие обоих факторов у промотора iNOS внутри клеток. Фактор некроза опухоли альфа, чей промотор также использует NF-kB, тоже снижался. Факторы активировались и достигали ядра, но хуже взаимодействовали со своей целевой ДНК.

Обратите внимание на отличие от пути 1. Здесь рассматривается взаимодействие фактора с ДНК, используется STAT1, а не STAT3, и измеряются мРНК, белок и нитрит, а не ASC specks и фрагменты каспазы-1. Наша карта мишеней метиленового синего в клеточных моделях отделяет этот уровень транскрипции от прямых измерений ферментов и митохондрий.

Путь 3: сывороточный IL-6 и активация STAT3 в тканях

IL-6 передаёт сигнал через семейство рецепторов gp130 в каскад Janus-киназа–STAT3. Фосфорилированный STAT3 димеризуется, входит в ядро и запускает воспалительные программы, а сам IL-6 является мишенью NF-kB, поэтому они образуют петлю обратной связи, которую часто называют осью IL-6–STAT3. Стандартные показатели включают сывороточный IL-6 выше по течению, отношение фосфорилированного STAT3 к общему STAT3 и эффекторные ферменты, такие как iNOS и COX2, ниже по течению.

Исследование IL-6 и STAT3 у мышей после липополисахарида 2023 года измеряло эту ось в разных компартментах. Самцы мышей C57BL/6 получали 1 мг на кг липополисахарида ежедневно в течение трёх дней, с 5 или 10 мг на кг метиленового синего через 30 минут после каждой дозы. На третий день сывороточный IL-6 был ниже в обеих группах метиленового синего по сравнению только с липополисахаридом, тогда как большинство других цитокинов в панели не изменялись после лечения. Соотношения фосфорилированного STAT3 к общему STAT3 были ниже в коре, гиппокампе и коже уха, с меньшим окрашиванием микроглии Iba-1, меньшими уровнями iNOS и COX2 и частично сниженной потерей массы тела.

Здесь важны два ограничения. Снижение сывороточного IL-6 вместе со снижением фосфорилирования STAT3 в тканях соответствует изменению оси, но не определяет первичный узел, поскольку одинаковое соотношение могут дать меньшее количество вышестоящего цитокина, меньшее рецепторное сигнализирование или изменение активности фосфатаз. А масса тела в течение трёх дней острого воздействия — это показатель всего организма, а не оценка симптомов или ремиссии. Он добавляет контекст за пределами одного вестерн-блота, но не превращает результат сигнализации в утверждение о лечении. Отдельная химия обработки митохондриального редокс-состояния идёт параллельно этому описанию цитокинов и не должна объединяться с ним.

Сравнение путей: точки воздействия и показатели

Таблица предотвращает три некорректных переноса. Результат ASC specks не доказывает результат STAT3. Результат связывания STAT1 с промотором iNOS не доказывает результат STAT3, хотя оба белка относятся к семейству STAT. Результат сывороточного IL-6 не доказывает снижение сборки инфламмасом: в эксперименте с перитонеальной жидкостью IL-1beta снижался, а IL-6 — нет. Каждый ряд требует собственного триггера и показателя, поэтому при чтении исследований метиленового синего на клетках, животных и людях необходимо сопоставлять каждое утверждение с измеренным уровнем.

Ничто из этого не устанавливает дозирование, безопасность или пользу для людей. Модели с липополисахаридом являются контролируемыми триггерами для проверки механизма, а не копиями хронических заболеваний, и введение вещества одновременно с триггером проверяет предотвращение индуцированного изменения, а не обращение уже установленного заболевания. Следует сохранять это описание механизмов отдельно от исходов у пациентов и оценивать любые утверждения о здоровье по исследованиям с участием пациентов, которые за ними стоят.