Интерпретация E. coli и других видов колоний на агаре EMB

Студент штрихует неизвестный образец на эозин-метиленовый синий агар, инкубирует его ночь и возвращается к чашке с темными колониями с зеленым отблеском. В журнале появляется запись «E. coli, подтверждено». Эта запись утверждает больше, чем может подтвердить чашка. Чашка показывает фенотип роста и ферментации в определенных условиях. Идентичность вида — отдельное утверждение, требующее отдельных доказательств.

Это руководство рассматривает результаты на агаре EMB как задачу интерпретации. Оно объясняет основную идею, проводит через иллюстративный атлас чашек с контролями и описывает случаи, когда учебная картина может вводить в заблуждение.

Идея, лежащая в основе чашки

Агар EMB является одновременно селективной и дифференциальной средой. Красители эозин Y и метиленовый синий подавляют многие грамположительные организмы, поэтому среда способствует росту грамотрицательных организмов. Те же красители действуют как индикаторы: когда организм ферментирует доступный сахар и производит достаточно локальной кислоты, колония интенсивно поглощает краситель и становится темно-фиолетовой или сине-черной. При интенсивном образовании кислоты поверхность колонии может проявлять металлическую зеленую иризацию. Протокол ASM для чашек с эозин-метиленовым синим агаром описывает это сочетание селекции и дифференциации и содержит эталонные фотографии для обучения.

Перед чтением любого результата важна одна деталь: проверьте, какая формула используется. Более старая формула Holt Harris Teague содержит лактозу и сахарозу, тогда как Levine EMB содержит только лактозу. Организм, который ферментирует сахарозу, но не лактозу, например многие изоляты Serratia marcescens, может выглядеть по-разному на двух вариантах. Документация производителя для сред EMB прямо указывает это различие формул. Запишите производителя и формулу в журнале рядом с результатом.

Приготовленный неинокулированный агар EMB обычно имеет красно-коричневый или красновато-фиолетовый цвет, иногда с зеленоватым оттенком или мелким осадком. Этот фоновый цвет не является ростом. Сравнивайте каждое чтение с неинокулированной чашкой или документированной исходной характеристикой и оценивайте основную чашку примерно после 18–24 часов аэробной инкубации при 35–37 C, если учебный протокол не указывает иное. Более длительная инкубация может изменить внешний вид ферментации.

Как смотреть на чашку

Используйте два типа освещения. Сначала осмотрите чашку при отраженном или косом освещении и наклоните ее: металлический блеск является иризирующим и может появляться или исчезать в зависимости от угла наблюдения. Затем исследуйте ее при проходящем свете, чтобы оценить цвет колонии и темные центры. Работайте с хорошо изолированными колониями, поскольку скопление и соседние колонии изменяют локальное накопление кислоты и могут подавлять или усиливать цвет. Набор изображений ASM показывает это напрямую: E. coli в смешанной культуре может потерять ожидаемый блеск, поскольку окружающие организмы изменяют кислотную среду.

Включайте контроли, когда это позволяет упражнение. Распространенный учебный набор включает E. coli ATCC 25922 для фенотипа сине-черного цвета и металлического блеска, неферментирующий организм, такой как Salmonella Typhimurium ATCC 14028 или Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, для бесцветного фенотипа, и грамположительный организм, такой как Enterococcus faecalis или Staphylococcus aureus, в качестве контроля подавления, как указано в стандартных таблицах контроля качества для сред EMB. Если положительный контроль не имеет блеска, сначала подозревайте инкубацию, скученность или формулу, а не неизвестный образец.

Иллюстративный атлас чашек

Ниже представлены сгенерированные иллюстрации, а не фотографии реальных культур. Они показывают характерный рисунок для поиска, а не точный оттенок какого-либо отдельного штамма. Сравнивайте их с эталонными фотографиями ASM и с реальными чашками из учебной лаборатории.

Чашка 1: Escherichia coli на агаре EMB, интенсивный ферментатор лактозы

E. coli на агаре EMB обычно имеет цвет от темно-фиолетового до сине-черного, часто с темным центром и металлическим зеленым блеском из-за интенсивного образования кислоты. Блеск — знаменитый признак, который ищут студенты, но его следует рассматривать как поддерживающее свидетельство, а не как определение. Интенсивность блеска зависит от штамма, времени инкубации, плотности колоний и угла наблюдения. Отсутствие блеска не исключает E. coli, а темная колония без блеска указывает на несколько других ферментаторов. Для последующей работы выбирайте хорошо изолированную колонию, а не участок с плотным ростом.

Чашка 2: Klebsiella pneumoniae на агаре EMB, слизистый ферментатор

Klebsiella pneumoniae на агаре EMB обычно образует крупные блестящие слизистые колонии розово-фиолетовых или коричнево-фиолетовых оттенков, часто с темными центрами, но обычно без выраженного металлического блеска. Подобная морфология встречается у родственных ферментаторов, таких как Enterobacter. Слизистая текстура и размер колонии являются частью оценки: розовая колония, которая мала и плоская, имеет другое значение, чем крупная куполообразная слизистая колония. Как и в случае с E. coli, чашка предлагает фенотип ферментации, а определение на уровне вида требует биохимического подтверждения, описанного ниже.

Чашка 3: Salmonella на агаре EMB и другие неферментирующие организмы, бесцветные колонии

Salmonella на агаре EMB и родственные неферментирующие лактозу организмы, включая Shigella и многие изоляты Pseudomonas, обычно растут в виде бесцветных, прозрачных или бледно-янтарных колоний. Некоторые формулы и условия дают слабый розоватый оттенок, поэтому бледно-розовая колония не является автоматически ферментатором. EMB не различает Salmonella, Shigella и другие неферментирующие организмы; это различие устанавливается последующими тестами. Также следует отметить, что были описаны лактозоположительные штаммы Salmonella с металлическими колониями, похожими на E. coli, что является еще одной причиной, по которой одна чашка не может окончательно решить вопрос.

Чашка 4: Serratia marcescens и ловушка формулы

Serratia marcescens заслуживает отдельного раздела, потому что студенты часто ожидают красные колонии и затем неправильно интерпретируют чашку. Большинство клинических изолятов не ферментируют лактозу, поэтому на Levine EMB они обычно выглядят бледными или слабо окрашенными. Поскольку многие изоляты ферментируют сахарозу, формула с сахарозой может давать более темную или связанную с кислотой реакцию. Не ожидайте классический красный пигмент продигиозин при 35–37 C: образование пигмента ненадежно при температуре инкубатора. Когда протокол указывает Serratia marcescens на агаре EMB, проверьте, какую формулу предполагает утверждение. Обзор метаболизма Serratia описывает лежащую в основе этой ловушки картину отрицательной по лактозе и изменчивой по сахарозе реакции.

Чашка 5: контроли и подавленные организмы

Грамположительные организмы, такие как Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus и Bacillus, обычно подавляются или значительно ограничиваются на агаре EMB, хотя подавление не является абсолютным для каждого штамма. Панель контролей делает интерпретацию достоверной: контроль E. coli должен показывать хороший рост с сине-черным цветом и блеском, контроль неферментатора должен показывать бесцветный рост, а контроль подавления должен показывать небольшой или отсутствующий рост. Если контроль подавления хорошо растет, селективный этап не сработал, и все остальные результаты этой партии вызывают сомнения. Методы окрашивания отвечают на другой вопрос, чем питательные среды; для части лаборатории, связанной с окраской мазков, см. атлас окрашивания метиленовым синим.

Ограниченное сравнение

Три предложения обобщают вводящие в заблуждение признаки. Темный цвет не означает E. coli, поскольку Klebsiella, Enterobacter и другие ферментаторы развивают темные центры без блеска. Розовый цвет не означает Klebsiella, поскольку умеренные или медленные ферментаторы и некоторые номинальные неферментаторы могут выглядеть розовыми или лавандовыми. Блеск не означает окончательно E. coli, поскольку другие интенсивные ферментаторы могут его создавать. Учебный протокол и его изображения смешанных культур демонстрируют каждую из этих ошибок.

Ограничения подтверждения

Агар EMB сообщает о фенотипе, а не о виде. Разные организмы могут иметь один и тот же вид колоний, а один организм может отклоняться от учебного образца из-за штамма, возраста, скученности, формулы и инкубации. Поэтому в учебных и клинических рабочих процессах морфология EMB рассматривается как предварительная.

Обоснованный рабочий процесс студента: описать изолированную колонию (размер, цвет, центр, блеск при косом освещении, слизистый характер), записать формулу, время и температуру инкубации, а также контроли; затем пересевать хорошо изолированную колонию до чистой культуры перед любым подтверждающим тестом. Обычное последующее исследование включает окраску по Граму плюс реакции IMViC для предварительной идентификации E. coli и колиформных организмов, TSI или KIA и специфические биохимические панели для энтерических организмов, а также серологическую идентификацию, MALDI TOF или другие валидированные методы, если этого требует задача. Для общего понимания места EMB среди селективных и дифференциальных сред для энтерических организмов см. введения в среды для культивирования энтерических бактерий и последующее окрашивание по Граму. Для связанного вопроса о том, что окрашивание синего препарата может и не может доказать, атлас окрашивания метиленовым синим сохраняет разделение наблюдения и вывода в том же духе.

Записывайте наблюдение до вывода. «Темно-сине-черные колонии с зависящим от угла зеленым блеском на Levine EMB через 24 часа, соответствующие интенсивной ферментации лактозы» — обоснованное утверждение. «E. coli, подтверждено» требует этапа подтверждения, который одна чашка сама предоставить не может.