Albastrul de metilen și Bartonella: rezultate de laborator și limitele dovezilor clinice

Un recipient de cultură și un pacient au în comun un cuvânt, infecție, dar nu și un concept. În recipient, infecția înseamnă un număr de colonii pe agar. La pacient, înseamnă bacterii în interiorul celulelor și al vaselor, medicamente care circulă prin sânge și țesuturi și un sistem imunitar care face o parte din muncă. Dacă le confundăm, o valoare impresionantă obținută în laborator începe să pară un tratament. Dacă le păstrăm separate, aceeași valoare rămâne ceea ce este: un motiv pentru a face următorul experiment.

Această delimitare este întregul scop al prezentei analize despre albastrul de metilen și Bartonella. Două studii de laborator ale aceluiași grup de cercetare au testat albastrul de metilen împotriva Bartonella henselae în stări fără creștere. Ambele au raportat o activitate puternică în recipiente din sticlă și plastic. Niciunul nu a inclus teste la oameni.

De ce testează cercetătorii faza staționară

Majoritatea testelor cu antibiotice folosesc celule în creștere. Acest model nu surprinde un caz mai dificil: celulele care au încetat să se dividă și tolerează medicamentele care omoară celulele similare aflate în creștere.

Bartonella poate persista în organism, inclusiv în interiorul eritrocitelor și al celulelor endoteliale. Prin urmare, grupul a investigat care medicamente aprobate pot omorî B. henselae după intrarea în faza staționară. O MIC scăzută împotriva celulelor în creștere nu a prezis distrugerea celor în fază staționară. Rifampicina avea o MIC foarte scăzută, dar omora puține celule în fază staționară, în timp ce compușii cu valori MIC mai mari le omorau eficient. Cititorii care doresc o metodă generală de analiză a acestui tip de articol o vor găsi în ghidul de lectură a cercetărilor despre albastrul de metilen.

Prima evaluare: Li și colegii, 2019

Evaluarea din 2019 a fazei staționare, publicată în Antibiotics, a folosit o singură tulpină, B. henselae JK53, cultivată în mediu Schneider cu 10 procente ser fetal bovin, la 37 C și cu 5 procente CO2. Culturile de o zi conțineau în principal celule dispersate, în diviziune. Culturile de cinci zile, cu aproximativ 10 la puterea a 8-a unități formatoare de colonii per mL, au fost considerate în fază staționară și conțineau agregate vizibile.

Testul a folosit SYBR Green I cu iodură de propidiu, calibrat pe amestecuri de celule vii și celule omorâte cu izopropanol. Deoarece albastrul de metilen este intens colorat, rezultatele pozitive au fost confirmate prin microscopie, apoi prin numărarea coloniilor pe agar cu sânge, criteriul de evaluare mai strict.

Dintre 1,581 de medicamente aprobate testate la 50 micromolar, albastrul de metilen a lăsat o viabilitate de 16 procente conform cititorului de microplăci și de 25 de procente conform microscopiei. Daptomicina a înregistrat 21 de procente, mai mulți azoli între 22 și 27 de procente, gentamicina 32 de procente, eritromicina 66 de procente, iar ciprofloxacina 74 de procente. Pamoatul de pirviniu părea mai activ conform cititorului, dar nu a putut fi evaluat prin microscopie din cauza propriei fluorescențe.

Împotriva B. henselae în creștere, MIC pentru albastrul de metilen a fost de 0.08 până la 0.16 micrograme per mL. În cazul celulelor în fază staționară de cinci zile, la 5 micrograme per mL, numărul coloniilor a scăzut până la absența coloniilor detectabile după o zi de expunere, la fel ca în cazul daptomicinei și al pamoatului de pirviniu la concentrațiile testate. Un experiment separat de evaluare a distrugerii bacteriilor în timp a folosit 10 micrograme per mL. Acestea sunt niveluri de expunere în laborator, nu doze, iar articolul le prezintă ca atare. O valoare citată a concentrației plasmatice maxime la om, de aproximativ 3.9 micrograme per mL, apare în articol doar ca informație de context. Prezentarea generală a farmacocineticii albastrului de metilen explică de ce o valoare plasmatică nu poate fi interpretată ca o valoare tisulară.

Două limite sunt explicite în articol. Nu a existat nici un model de biofilm, nici testarea albastrului de metilen în combinații. Agregatele de cinci zile erau grupări de celule într-o cultură lichidă în fază staționară, nu un experiment validat cu biofilm. Autorii au solicitat studii pe animale, studii ale combinațiilor, studii pe biofilm și teste pe alte specii de Bartonella.

Combinații și celule provenite din biofilm: Zheng și colegii, 2020

Studiul ulterior din 2020, publicat în BMC Microbiology, a păstrat aceeași tulpină și același mediu, dar a trecut la culturi în fază staționară de șase zile și a adăugat două elemente care lipseau din primul articol: combinații de două medicamente și un model de celule provenite din biofilm.

Pentru medicamentele testate individual la o concentrație uniformă de 5 micrograme per mL timp de 24 de ore, albastrul de metilen a lăsat 3.2 ori 10 la puterea a 4-a unități formatoare de colonii per mL, față de aproximativ 2.8 ori 10 la puterea a 10-a în proba de control. Ciprofloxacina, gentamicina și nitrofurantoina au lăsat mai puține colonii la același moment. Acest rezultat diferă de cel din 2019, când aceeași concentrație nominală nu a lăsat colonii detectabile după o zi. Vârsta, densitatea și manipularea culturilor au fost diferite, astfel încât distrugerea bacteriilor a fost reproductibilă ca tendință, dar nu identică în amploare. Această variație de la un experiment la altul este unul dintre motivele pentru care verificările standard de siguranță și de interacțiuni tratează potența de laborator separat de efectul clinic.

Evaluarea combinațiilor este partea citată cel mai frecvent. Fiecare componentă a fost menținută la 5 micrograme per mL. Atât azitromicina plus albastru de metilen, cât și rifampicina plus albastru de metilen nu au lăsat colonii detectabile în fază staționară la 24 de ore; același rezultat a fost obținut pentru ambele combinații cu ciprofloxacină. Dintre cele 25 de combinații testate, doar aceste patru au avut acest rezultat. Nu s-a efectuat o analiză formală a sinergiei, astfel că termenul corect este combinație activă în aceste condiții, nu sinergie demonstrată.

Experimentul cu biofilm a testat celule recuperate dintr-un biofilm tânăr dezagregat, nu pătrunderea într-un biofilm matur intact. Culturile au fost crescute timp de cinci zile, diluate în plăci cu godeuri pentru încă cinci zile, confirmate prin colorare cu violet de cristal, apoi raclate înainte de expunerea la medicamente. La 5 micrograme per mL, albastrul de metilen administrat singur a redus numărul la 2.3 ori 10 la puterea a 2-a până în ziua 6, fiind printre cei mai activi agenți testați individual, dar fără a ajunge la zero. Ambele combinații cu albastru de metilen au ajuns la zero până în ziua 6, la fel ca ambele combinații cu ciprofloxacină.

Autorii au semnalat aceleași limite pe care le-ar identifica un cititor atent: biofilm tânăr raclat, nu biofilm vechi intact; o singură concentrație convenabilă pentru toate medicamentele, nu concentrația maximă realistă specifică fiecăruia; doar anumite combinații centrate pe azitromicină sau rifampicină; o singură tulpină; fără animale; fără pacienți. Studii ulterioare cu trei medicamente au fost propuse, nu raportate.

Comparația proiectării studiilor

Tabelul rezumă ideea centrală a acestui articol. Tot ce se află la stânga ultimei coloane reprezintă experimente pe culturi. Nimic din cele două articole nu se încadrează în ultima coloană.

Bartonella nu este Borrelia

Ambele articole menționează Borrelia burgdorferi, spirocheta care provoacă boala Lyme, deoarece testul cu coloranți provenea din studii anterioare asupra Borrelia în fază staționară, realizate în același laborator, în care albastrul de metilen și daptomicina fuseseră, de asemenea, identificate ca active. Acest istoric oferă un context util și este o sursă frecventă de erori.

Niciun experiment din cele două articole despre Bartonella nu testează Borrelia în paralel cu Bartonella. Organismele diferă, mediile diferă, concentrațiile diferă, iar efectul presupus al albastrului de metilen asupra membranei la Bartonella a fost prezentat ca o ipoteză care necesită studii suplimentare. Rezultatele nu trebuie extrapolate de la o specie la alta, iar niciunul dintre articole nu susține afirmații generale despre paraziți. Din acest motiv, comparația celulelor persistente de Borrelia și Bartonella păstrează separate cele două corpuri de literatură.

De ce culturile nu se transformă într-un protocol

Interesul pentru căutarea unui protocol cu albastru de metilen pentru Bartonella este de înțeles. Aceste articole arată de ce sintagma respectivă ar trebui tratată ca un semnal de avertizare, nu ca o listă de cumpărături.

În primul rând, 5 micrograme per mL într-un godeu nu reprezintă o prescripție. Valoarea nu include informații despre absorbție, distribuție, legarea de proteine, pătrunderea intracelulară sau tolerabilitate. Autorii au ales-o ca medie aproximativă a concentrațiilor maxime ale antibioticelor și au precizat că studiile viitoare ar trebui să folosească fiecare medicament la propria concentrație realistă.

În al doilea rând, zero colonii înseamnă absența coloniilor în acele condiții de însămânțare, nu țesut steril. Celulele persistente, bacteriile intracelulare și limitele prelevării probelor rămân toate în afara plăcii cu agar.

În al treilea rând, combinațiile care sterilizează un godeu pot eșua sau pot provoca efecte nocive în organism. Azitromicina plus albastru de metilen și rifampicina plus albastru de metilen sunt combinații de laborator, la niveluri de expunere de laborator. Fără date farmacocinetice la animale și date controlate la oameni, nu există o doză, o durată sau un raport beneficiu-risc stabilite. Oricine evaluează opțiunile ar trebui să le discute cu un clinician și să consulte informațiile despre situațiile în care utilizarea albastrului de metilen necesită supraveghere medicală înainte de a trage vreo concluzie din datele obținute în recipiente de cultură.

Concluzia restrânsă pe care o susțin aceste articole este următoarea: albastrul de metilen are o activitate reproductibilă împotriva B. henselae JK53 care nu se află în creștere, in vitro, inclusiv în combinații de două medicamente testate în laborator, cele mai puternice rezultate pentru combinații și celule provenite din biofilm fiind obținute în studiul din 2020. Orice alt aspect, inclusiv dacă această activitate are relevanță pentru bartoneloza umană, rămâne netestat.